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铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖的、脂质过氧化物累积的新型细胞死亡方式，与肿瘤的发生、发展和耐药密切相关。自从铁死亡被发现以来，就以一己之力掀起研究狂潮，至今热度不减，俨然成为医学科研领域热门的研究方向，也是近些年国自然基金热点资助项目。
今天，小薇跟大家分享一篇“9+”铁死亡文献思路，手把手教你铁死亡实验设计。
文献信息
文章题目：Cetuximab promotes RSL3-induced ferroptosis by suppressing the Nrf2/HO-1 signalling pathway in KRAS mutant colorectal cancer（在KRAS突变型结直肠癌中，西妥昔单抗通过抑制Nrf2/HO-1信号通路促进RSL3诱导的铁死亡）
杂志：Cell Death and Disease （IF: 9.865）
研究设计
1. 研究西妥昔单抗对RSL3对KRAS突变CRC细胞的细胞毒作用的影响
使用4个KRAS突变的CRC细胞株（HCT116、DLD-1、LOVO和SW480）分别用RSL3单独或联合西妥昔单抗处理24小时，研究药物对细胞存活率的影响。通过存活率结果，后续实验选择HCT116和DLD-1细胞。研究RSL3、西妥昔单抗和二者联合处理24小时后对两种细胞存活率、细胞形态改变、集落形成能力等的影响。
2. 研究西妥昔单抗对KRAS突变CRC细胞中RSL3诱导的铁死亡的影响
为了研究RSL3和西妥昔单抗是否会促进铁死亡，在KRAS突变体HCT116和DLD-1细胞中评估了铁死亡相关指标，即脂质活性氧（ROS）积累、丙二醛（MDA）水平，细胞内的铁水平等。而且，细胞内加入铁死亡抑制剂Fer-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂necrostatin-1或自噬抑制剂3-MA，研究哪种抑制剂可以抑制RSL3和西妥昔单抗处理对HCT116和DLD-1细胞生长的抑制。
3. 研究RSL3和西妥昔单抗联合处理对KRAS突变CRC细胞中的Nrf2/HO-1轴的影响
Keap1是细胞对氧化应激反应的主要调节因子。氧化应激后，Keap1与Nrf2分离，导致Nrf2积累，核易位，激活靶基因HO-1的转录。因此，本研究首先研究了RSL3和西妥昔单抗联合处理对Keap1、Nrf2、HO-1等蛋白的影响；然后敲除Nrf2，评估Nrf2表达对西妥昔单抗和RSL3处理KRAS突变CRC细胞的存活率以及铁死亡相关指标的影响。
4. 研究西妥昔单抗是否通过激活p38 MAPK调节Nrf2/HO-1轴
为了研究p38 MAPK在Nrf2/HO-1表达中的作用，评估了西妥昔单抗和SB202190 （p38的特异性抑制剂）对HCT116和DLD-1细胞中p38活性、Nrf2和HO-1表达的影响；研究RSL3、西妥昔单抗和SB202190处理对细胞存活率的影响。然后，在两种细胞中过表达Nrf2或HO-1，研究过表达Nrf2或HO-1后对西妥昔单抗和RSL3联合处理的细胞的存活率的影响。
5. 体内试验研究西妥昔单抗在体内是否能促进RSL3诱导的铁死亡
构建异种移植裸鼠模型，探讨西妥昔单抗在体内是否能促进RSL3诱导的铁死亡。研究RSL3、西妥昔单抗及二者联合处理对肿瘤重量、肿瘤大小、肿瘤体积、体重；体内MDA水平；以及Nrf2、HO-1和Keap1蛋白水平的影响。
主要结果
1. 西妥昔单抗增强RSL3处理对KRAS突变CRC细胞的细胞毒性作用
研究发现，西妥昔单抗处理增强了RSL3对HCT116和DLD-1细胞的细胞毒作用（图1A，B）。与RSL3或西妥昔单抗处理相比，RSL3和西妥昔单抗联合处理显著抑制了细胞增殖（图1C）。提示西妥昔单抗处理通过显著抑制细胞活力、抑制细胞增殖，增强RSL3对KRAS突变CRC细胞系的细胞毒作用。
图1 西妥昔单抗增强RSL3对KRAS突变CRC细胞的细胞毒作用
2. 西妥昔单抗增强KRAS突变CRC细胞中RSL3诱导的铁死亡
采用脂质过氧化探针C11-BODIPY581/591检测细胞内脂质ROS水平，发现RSL3和西妥昔单抗联合处理后，脂质ROS积累显著增加（图2A）、MDA水平显著升高（图2B）。西妥昔单抗对HCT116或DLD-1细胞系的脂质ROS积累和MDA水平没有影响，但增强了RSL3诱导的脂质ROS水平和MDA水平的增加（图2B）。而且，与RSL3单独处理相比，RSL3和西妥昔单抗联合处理的细胞发出更强的橙色荧光（图2C）。此外，RSL3和西妥昔单抗处理增加了对HCT116和DLD-1细胞生长的抑制，这种效果被铁死亡抑制剂Fer-1逆转（图2D）。这些结果表明，西妥昔单抗能增强KRAS突变CRC细胞系中RSL3诱导的铁死亡。
图2西妥昔单抗治疗可增强KRAS突变CRC细胞中RSL3诱导的铁死亡
3. RSL3和西妥昔单抗联合处理可抑制KRAS突变CRC细胞中的Nrf2/HO-1轴
Western blot分析显示，RSL3和西妥昔单抗处理后，Keap1表达增加，抑制Nrf2/HO-1信号转导（图3A）。在HCT116和DLD-1细胞中，siRNA转染48 h可降低Nrf2及其下游靶点HO-1的表达。与RSL3组相比，RSL3处理的转染组中Nrf2和HO-1水平降低（图3B）。转染靶向Nrf2的siRNA可以提高HCT116和DLD-1细胞对RSL3的敏感性（图3C）。而且，Nrf2敲低提高了RSL3诱导的MDA水平（图3D）、细胞内脂质ROS水平（图3E）和细胞内铁积累（图3F）。这些结果表明，RSL3和西妥昔单抗联合处理可抑制KRAS突变CRC细胞中的Nrf2/HO-1信号。
图3 RSL3和西妥昔单抗联合处理可抑制KRAS突变CRC细胞中的Nrf2/HO-1轴
4. 西妥昔单抗激活p38 MAPK并调节Nrf2/HO-1轴
西妥昔单抗或SB202190处理的细胞中p38蛋白水平与对照组无差异。西妥昔单抗显著提高p-p38水平，但当西妥昔单抗与SB202190联合处理时，这种作用被消除（图4A）。而且，西妥昔单抗处理降低了Nrf2和HO-1的表达，而SB202190降低了西妥昔单抗介导的Nrf2和HO-1的抑制（图4A）。此外，RSL3和西妥昔单抗诱导的HCT116和DLD-1细胞的死亡被SB202190部分挽救（图4B）。而且，Nrf2过表达或HO-1过表达逆转了西妥昔单抗和RSL3联合处理对CRC细胞的存活率的抑制（图4D-F)。此外，t-BHQ处理激活Nrf2或hemin处理激活HO-1部分逆转了RSL3和西妥昔单抗处理对HCT116和DLD-1细胞的生长抑制(图4G, H)。这些结果表明p38 MAPK参与调控Nrf2和HO-1的表达，西妥昔单抗可以通过p38 MAPK的激活抑制Nrf2/HO-1通路。
图4 西妥昔单抗激活p38 MAPK并调节Nrf2/HO-1轴
5. 在异种移植裸鼠模型中，西妥昔单抗通过抑制KRAS突变CRC细胞中的Nrf2/HO-1轴来增强RSL3诱导的铁死亡
在DLD-1异种移植裸鼠模型中，RSL3单独和西妥昔单抗和RSL3联合治疗均可导致肿瘤大小的减小，并且在两种药物联合治疗组中肿瘤大小的减小幅度最大（图5B-D)。对照组和处理组的体重和每日摄食量没有显著变化（图5E）。然后我们测试西妥昔单抗和RSL3联合治疗是否能在体内调节脂质过氧化。值得注意的是，联合组MDA浓度水平显著提高（图5F）。Western blot结果显示， RSL3和西妥昔单抗共同处理后，Nrf2和HO-1的相对水平降低，keap1的表达相对增加（图6A）。免疫组化染色同样证实、RSL3和西妥昔单抗共同处理后，Ki67、Nrf2和HO-1低表达，keap1高表达（图6B）。这些体内结果证实，西妥昔单抗通过抑制Nrf2/HO-1活化来增强RSL3诱导的铁死亡。
图5 西妥昔单抗在体内增强了RSL3和RSL3诱导的ferroptosis的抑制作用
图6 西妥昔单抗通过抑制Nrf2/HO-1轴在体内增强RSL3诱导的铁死亡
以上就是本研究的主要内容啦，研究逻辑比较清晰，实验方法比较常规，易复现。希望这个研究思路能够给你带来一些灵感，说不定还能适当的运用到标书设计中呢，如果觉得这个思路对你有所帮助，请转发点赞哦。
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