桑组织培养文献综述

桑(拉丁名:Morus alba L.)是桑科,桑属 落叶乔木或灌木,高3-10米或更高,胸径可达50厘米,喜温暖湿润气候,稍耐荫。气温12℃以上开始萌芽,生长适宜温度25-30℃,超过40℃则受到抑制,降到12℃以下则停 止生长。耐旱,不耐涝,耐瘠薄。对土壤的适应性强。树皮厚,灰色,具不规则浅纵裂;冬芽红褐色,卵形,芽鳞覆瓦状排列,灰褐色,有细毛;小枝有细毛。叶卵形或广卵形,长5-15厘米,宽5-12厘米,先端急尖、渐尖或圆钝,基部圆形至浅心形,边缘锯齿粗钝,有时叶为各种分裂,表面鲜绿色,无毛,背面沿脉有疏毛,脉腋有簇毛;叶柄长1.5-5.5厘米,具柔毛;托叶披针形,早落,外面密被细硬毛。花单性,腋生或生于芽鳞腋内,与叶同时生出;雄花序下垂,长2-3.5厘米,密被白色柔毛,雄花。花被片宽椭圆形,淡绿色。花丝在芽时内折,花药2室,球形至肾形,纵裂;雌花序长1-2厘米,被毛,总花梗长5-10毫米被柔毛,雌花无梗,花被片倒卵形,顶端圆钝,外面和边缘被毛,两侧紧抱子房,无花柱,柱头2裂,内面有乳头状突起。

聚花果卵状椭圆形,长1-2.5厘米,成熟时红色或暗紫色。花期4-5月,果期5-8月。

叶为桑蚕饲料.木材可制器具,枝条可编箩筐,桑皮可作造纸原料,桑椹可供食用﹑酿酒,叶、果和根皮可入药。是具有极高经济价值的作物。

概述:

桑的组织培养,最早由日本的大山胜夫在1968年作了报道,而在60年代,广岛大学的研究人员首先使用了MS培养基对分离茎的愈伤组织进行了继代培养,最先取得成功。其后到1968年大山胜夫用桑子发芽后长出的胚茎,实生苗及叶柄长出的愈伤组织,进行继代分离培养,第一步诱导愈伤组织,切取上述各种无菌的愈伤组织,植入加无机盐、蔗糖和1-3 ppm2·4-D的琼脂培养基上,7一10天后即产生愈伤组织;第二步分离培养愈伤组织,把上述各组织产生的愈伤组织分离下来,用诱导愈伤组织的同一培养基进行培养,这些愈伤组织就继续不断地连续增殖,当把愈伤组织置于加入NAA(萘乙酸)的培养基,就从愈伤组织的细朱分化长出桑根。而愈伤组织的培养出现进展的时间相对较晚。山本、蒲田( 1971 )、关博夫( 1971 )、冈、大山(1976)报道了植物激素对愈伤组织生长的影响,关于培养的条件,特别是愈伤组织的再分化至今还有许多问题没能获得解决。桑的愈伤组织生长要比其他的慢,在继代培养中常常发生生长停止的现象,桑的愈伤组织可以较容易通过各器官的培养而获得,但一般都难于得到再生的植株。在愈伤组织的培养过程中比较容易产生不定根。直到1985年押金通过下胚轴培养获得的愈伤组织分化出不定芽,而育成了桑的再生植株。另外山本等(1986)成功地进行了大规模的愈伤组织的液体培养,今后随着愈伤组织再分化技术的建立,可望能在短期内获得大量的分化苗,从而进行种苗的工厂化生产。

桑树的器官培养,1974年冈成美和大山胜夫首次成功用离体冬芽培养诱导出具有根茎叶的桑苗。在国内,1980年,吉林蚕业研究所用实生苗的茎尖培养诱导出具有根、茎、叶的小桑苗。1981年,陕西省蚕桑研究所的马风桐等使用离体桑树冬芽第一次成功的诱导出具有根茎叶的完整桑树,第二年又诱导出多芽苗,在桑组织培养方面取得了重要成就。中国农业科学院蚕业研究所孙晓霞等1985年通过未受精和受精胚珠培养获得再生植株,陈爱玉等1989年进行了幼胚的培养也都获得植株。山东省蚕业研究所的孔令汶等1987年用2~3mm大小的一张叶片产生了20多个不定芽,这对保存优良株系,工厂化繁殖无性系开辟了新途径。

花药和未受精子房的培养,这种培养方式旨在通过花药和子房培养获得单倍体植株,然后经过加倍而获得纯合二倍体,从而使优良的隐性基因得以表现,对扩大育种素材,提高育种成效将起到重要的作用,不但如此,还可望通过杂交而获得一代杂交种,改变历来采用的无性繁殖方法为有性繁殖,从而大大简化生产的工艺流程,降低成本,提高效益,鉴于单倍体育种有许多优点,中国研究人员林寿康 1980年通过研究实验成功获得了无根花粉植株,1984年成功地在世界上首次获得桑树花药培养的单倍体植株,并移栽于大田成活。1989年又成功地获得未受精子房培养的单倍体植株,确立了完整的花药和未受精子房培养体系,并通过培养方法和培养基的改进使快速育苗向工厂化迈进了一步。

直到最近几年,有关桑的植物组织培养研究仍在继续,桑通过组织培养育苗并将其工厂化仍需继续研究和探索。

桑植物组织培养报道概况

1.    茎叶,冬芽(去芽鳞) 诱导:MS培养基( p H5,8-6,蔗糖3%,琼脂浓度0.8%),并加入6-苄氨基嘌呤( BA) .0.5毫克╱升,IAA(吲哚乙酸)1毫克╱升1984年,李荣宗

2.    茎叶,冬芽 诱导:培养条件:以MS为基本培养基。附加(单位mg/L)BA 2, BA 1,ZT 0.5, BA 2,IAA 0.1,蔗糖3%,琼脂0.7%,pH 5.8~6.0。培养室温度26~~28℃﹔光照强度2000lx。1984年,常晋淑

3.    茎段,腋芽 诱导:MS附加6BA( 细胞分裂素)、IBA(吲哚丁酸)、琼脂粉、3 %蔗糖、pH5.8的固体培养基上。按种材料在28℃中暗培养7天,再移入每天10小时光照,光照强度为1000lux,室温26 ℃下,经7~10天,冬芽或腋芽开始萌发生长,30天左右初代无菌苗高2.5~5cm.转移至LS培养基,附加6 BA,IBA,NAA(萘乙酸),蔗糖。1986年,张国彬等

4.    腋芽,幼叶  诱导:MS+0.2NAA生根培养基,待萌发到一定程度时转入0.3NAA+0.15BA(单位mg/L)。2003年,刘明辉

5.    腋芽,幼叶  诱导:MS+0.2NAA生根培养基,待萌发到一定程度时转入0.3NAA+0.15IBA(单位mg/L)。2003年,刘明辉

6.    叶芽 启动培养基:1/3MS+6 -BA0.1mg/L+IAA 0.1mg/L+2%食用蔗糖。芽增殖培养基:MS+6- BA0.35mg/L+ NAA 0.1mg/L+2%食用蔗糖。壮苗及生根培养基:1/2MS + NAA0.15mg/L+IAA 0.lmg/L+1%食用蔗糖。2010年,王凤军

7.    腋芽 诱导:MS+6-BA(1.0mg/L)+GA3(0.5-1.0mg/L)+IBA(0.5mg/L),琼脂7.4g/L,蔗糖20g/L,Ph6.0。2011年,曹伟等

8.    冬芽 启动培养基:MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。分化培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L+ 2,4-D 0.1 mg/L。生根培养基:MS +NAA 0.1 mg/L。2011年,赵艳燕

9.    幼茎,叶片 诱导:MS+1.0BA+0.5IAA,琼脂7.4g/L,蔗糖20g/L,pH6.2,25℃,光照强度4000lx。2012年,张文平

10.   幼茎,叶片 诱导:MS+2.0BA+0.5IAA,琼脂7.4g/L,蔗糖20g/L,pH6.2,25℃,光照强度4000lx。2012年,张文平

11.   幼茎,叶片 诱导:MS+8.0BA+0.5IAA,琼脂7.4g/L,蔗糖20g/L,pH6.2,25℃,光照强度4000lx。2013年,王琳

12.   腋芽 诱导:MS+30g/L 2mg/升及吲哚乙酸(IAA)0.2mg/L,PH为5.8,加入3 g/升的琼脂,培养条件为温度28±1℃,光照强度3000lx。1987年,片桐幸逸·西口达郎

13.   冬芽 诱导:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。2012年,刘佳

14.   茎段,腋芽 诱导:WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L。2012年,刘佳

桑组织培养研究

(1)培养条件对芽增殖的影响

通过直接再生途径,侧芽和不定芽从初始外植体长出并进一步形成分支。以往的研究证明,MS基质对于桑树芽增殖是适宜的,但对于较老的外植体,LS基质中的维生素并结合活性炭可以避免其出现褐化。自1976年以来在对M·a lba组织培养体系的研究中,蔗糖一直是芽增殖的首选碳源。3%果糖虽然可以在初代培养中促进芽的萌发,但仍需转入添加蔗糖的继代培养基促进芽生长。培养在添加了葡萄糖的MS基质上的芽则先呈现浅绿色玻璃化状态而后枯萎死亡。在添加了麦芽糖的培养基上进行培养,只能从叶子的叶腋部诱导出芽,但并没有显现出增殖反应以及芽的进一步生长。6—BA(0.5~2.0 mg/L)可以高效的从顶芽,侧芽和茎段诱导芽增殖。在桑树以外的其他植物中,BA与其他生长素相比在试管内诱导芽增殖方面也具有优势, 1.0 mg/1 BA对于芽的诱导及伸长是最适的。而把6-BA作为首选的原因是相对于其他的合成生长调节剂6-BA代谢更稳定。另外BAP能够诱导植物组织中天然激素的生成。但是如选择叶,胚轴或子叶作为外植体诱导不定芽,则TDZ被证实比6一BA更适合,但同时在促进茎伸长方面不如 BAP有效,所以在继代过程中仍需转移到含6一BA的培养基中促进茎伸长。

(2)外植体特性对芽培养的影响

桑在组织培养时外植体的不同也会对培养的难度和培养基的配制以及最终达到的效果产生显著影响。1981年,Oka & Ohyama证实了不通过中间愈伤组织形成阶段,以桑叶作为外植体可以直接诱导不定芽形成。同一时期,出现了从子叶和胚轴外植体诱导茎器官再生体系的报道。尽管关于桑树组织培养的报道已有很多,但是具有不同遗传特异性的品种对相同培养条件的反应仍不相同。除了生长调节剂和外植体类型,外植体的树龄对芽增殖能否成功也有重要影响。现已证实,增加BA的用量对于树龄超过十年的树木能显著提高芽繁殖率。对于树龄较长且单独使用6-BA茎不能延长的芽,在接种到添加6-BA ( 1.0 mg /L)和GA3 (0.5~1.0 mg/L)的MS培养基进行继代后能促进其延长。针对不同种的培养材料,季节对侧芽萌发也有较大影响,季节导致的差异在试管培养和扞插中都存在。综合多个研究实验的结果可以基本确定四月到九月之间取得的外植体比十月到来年三月间采集的外植体。从试管内繁殖的茎上取得的茎段和茎尖比从农田中取得的外植体具有更高的增殖率。

(3)根的诱导

要将在试管内发育的芽进一步培育并得到成活的移栽再生植株,根的诱导和发育是至关重要的。相比草本植物而言,试管内培桑的过程中出现的较低的生根率仍是亟待解决的问题。目前对于组织培养条件下产生的桑树的不定根的组织来源仍不明确。由于多数不定根通过愈伤组织形成,就形成了一种观点认为愈伤组织内的分化导致了根原基的形成,愈伤组织对于根的形成是必不可少的。尽管在无生长调节素的条件下诱导根的形成已经得到证实,目前大部分桑树诱导根的研究都应用了生长调节素。将试管中培养得到的茎切成1—3m的小段,培养在单独或联合应用了 IAA,IBA或NAA的MS培养基中。在查阅资料过后,可以得出0.5mg/L的IBA效果最好。而且也有研究证明遗传特异性也影响了培养基内诱导桑不定根形成的成功率。

(4)愈伤组织的诱导

愈伤组织的形成在桑的组织培养过程过十分重要,这方面的研究也较为成熟。桑属中使用添加生长素的培养基能启动愈伤组织形成,相比其他生长素,如IAA,IBA,NAA,2,4-D ( 2.0 mg /L)被证实是诱导桑树愈伤组织的首选。在Mons- indica的愈伤组织诱导过程中,将生长素和细胞分裂素结合或者将外植体在低浓度细胞分裂素中浸泡能进一步促成愈伤组织发育。但如果外植体是取自在高浓度生长素培养条件下抽出的茎段,则不需要低浓度细胞分裂素进行预处理。除了生长调节剂,愈伤组织生成也受外植体类型和基因型的影响。目前已证实通过诱导愈伤组织进一步分化获得再生植株并不适用于桑树所有的基因型,而且不同基因型间的诱导率也存在较大差异。诱导愈伤组织常通过试管内培养后再取较幼嫩的叶片作为外植体,也有用茎段和胚轴诱导成功的报道。茎段相比胚轴在诱导愈伤和器官再生阶段具有更强的反应性。已有研究证实,试管内愈伤组织再生对于具有遗传特异性的不同植株不具有普遍性,而且再生的比例在具有不同遗传特异性的植株中也存在差异。

桑的组织培养研究价值以及存在的问题

桑作为一种具有重要经济价值的作物,在几千年来一直都发挥着不可替代的作用。采用组培繁殖可以迅速大量繁殖生产用无毒苗,可大大提高成活率,减少病害,降低了苗木生产成本,满足苗木市场的需要,如何增强组培工厂化育苗的可操作性是现在桑组培研究人员最为关切的问题。

目前,所涉及的理论与应用问题很广泛,不仅具有生产上、育种上的实用价值,而且有助于对桑树遗传学、生理学等的深入研究,查阅资料后得知,目前主要存在以下几点问题:

1.器官分化的规律问题。目前,在这方面研究中较为成功的例子花粉与胚培养的胚状体(或不定芽)方化、胚轴与叶片培养的不定芽分化,愈伤组织的不定芽分化等,但其中分化频率不高、重现性较差的问题有待解决。另一方面,由桑树茎叶获得的愈伤组织和原生质体的培养迄今未见胚胎发生的报道,这在一定程度上限制了桑组织培养研究工作的进展。因此,有必需对器官发生的过程及其机理作深入的研究。

2.遗传变异的规律问题。桑愈伤组织培养中的丰富变异可以用作育种的原始材料;利用纯合个体进行遗传分析,可以提高杂交育种频率,在培养基中加入筛选剂,可以选拔抗性强的个体;然而,目前对变异的获得、变异频率与方向、变异个体的筛选以及植株再生技术等还缺少研究。因此,探讨组织培养中的遗传变异规律仍是今后的重要课题。

目前关于桑的组织培养的报道有很多,但要达到生产上大规模应用并收到经济效益的目标,却还有一段距离。从既有研究成果看,除在育种上的应用外,组织或细胞的长期保存技术将使桑种质资源的保存工作大幅度地节省土地和劳力。我国最早的桑树人工栽培最早要追溯到公元前2800年,蚕桑生产的不断进步也是我国纺织行业发展的一个缩影。如今桑组织培养虽有难题存在,但是我相信通过科研人员的不断努力,进一步改进试管苗的大量繁殖技术,将使工厂化育苗成为可能终会实现。可以预见,通过人们的不懈努力,桑树的组织培养工作将会取得更大的成绩。

参考文献

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