标题：Transcriptomic and metabolomic landscape of quinoa during seed germination.
期刊：BMC Plant Biology (IF =4.215)
时间：2022.05
研究背景
藜麦（Chenopodium quinoa）双子叶植物，因其高营养价值与优秀的抗逆性成为当今世界范围内的新兴作物。种子的萌发过程是一个重要的多重生理过程，藜麦种子的萌发网络调控在很大程度上是未知的。
实验样本
为了更好地了解生理变化，作者对藜麦干种子进行了种子发芽试验，从藜麦干种子到幼苗的过渡过程中分五个阶段取样进行研究。
研究内容
01.藜麦种子萌发过程中的动态变化
作者为了确定参与调节藜麦种子萌发到幼苗阶段过渡的关键基因，首先对干燥种子（阶段 I）、吸涨种子（阶段 II）、胚根萌发（阶段 III）、下胚轴伸长（阶段 IV）和子叶扩展（阶段V）这五个阶段的样本进行了RNA-seq 分析。转录组数据获得了超过 35,000 个表达的转录本，主成分分析（PCA）显示了 II 阶段和 III 阶段之间比于五个阶段的整体分布有部分重叠，其次通过统计学差异分析筛选差异表达基因（DEGs），结合维恩图展示任意两个相邻阶段之间鉴定的DEGs，表明各阶段之间的特异性。可以看出种子萌发的不同阶段之间所鉴定出的数千个上调或下调的基因表明每个阶段间的特异性，而阶段 II 与阶段 III 中仅鉴定出少量的 DEG，结合PCA结果表明这两个阶段相似性较高。
为了更好地探索从藜麦干种子到幼苗过程中代谢水平上的动态变化，作者接下来对五个不同阶段的样品进行了代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示了不同阶段之间的分离情况，表明在种子萌发过渡期间发生了代谢变化。结合维恩图展示了任何两个相邻阶段之间的差异代谢物情况，表明了各阶段之间的特异性。
02.植物激素信号在藜麦种子早期萌发中起重要作用
作者在统计学分析得到对应比较组差异指标的基础上通过KEGG富集分析注释进一步了解藜麦种子萌发过程中的全局表达模式，藜麦种子萌发不同阶段鉴定的DEGs的KEGG分析表明在藜麦种子萌发的快速过渡期间出现了多个阶段的特定过程。
进一步具体分析发现，在干燥种子开始发芽的第一阶段的KEGG分析中，“植物激素信号转导”条目显著富集，随后是“淀粉和蔗糖代谢”等其他通路，脱落酸（ABA）在植物种子萌发调控中起重要作用已有充分证明，因此作者首先通过ELISA分析了发芽藜麦种子中ABA的含量，结果表明干燥种子（第一阶段）的ABA水平最高，并且在随后的发芽阶段显著下降，表明ABA可能在抑制种子萌发方面发挥作用。结合已有研究使用热图分析来查看参与 ABA 代谢的 DEG 的转录模式，CqABA1、CqNCED5和CqNCED6基因在干种子中显示出比发芽种子更高的表达水平（其中CqABA1和CqNCED5的转录水平的增加是在种子萌发的最后阶段观察到）。CqCYP707A1在干燥种子中表达水平较低，但在后期增加，推测可能有助于种子萌发过程中 ABA 含量的降低。随后通过qRT-PCR进一步验证了 CqABA1（AUR62001926）和CqCYP707A1（AUR62030408 ）的转录水平。CqABA1的下调和CqCYP707A1的上调导致藜麦早期萌发过程中ABA含量的降低。最后，作者鉴定了编码 ABA 信号核心成分的 DEG，编码 ABA 受体的CqPYL 、编码 PP2C 蛋白磷酸酶的CqHAI / CqAHG1和编码 SnRK2 蛋白激酶的 CqSnRK2 。CqPYLs的相对低转录水平和CqPP2C的高水平表明 ABA 信号通路在干燥种子中趋于沉默。除ABA作者还分析了与其他植物激素相关的DEG，包括赤霉素（GA）、生长素和细胞分裂素。相关基因的上下调结果表明，在藜麦种子萌发过程中，需要ABA和GA信号及其与其他激素信号的潜在整体配合。
03.藜麦发芽过程中的营养和能量代谢被激活
休眠状态下种子中的代谢活动很弱或是沉默，直到打破休眠并开始种子发芽。一旦萌发被激活，包括淀粉、蔗糖、蛋白质和脂质在内的储备在萌发过程中被调动以使种子得以过渡为幼苗。在藜麦种子萌发的早期阶段可能发生淀粉和蔗糖代谢以提供营养和能量。为了确定促进种子发芽的重要基因，对淀粉和蔗糖代谢途径中的主要成分进行搜索。鉴定到编码 α- 和 β- 淀粉酶的CqAMY1和CqBAM3基因在种子萌发后显著增加，表明它们分别在引导淀粉转化为葡萄糖和麦芽糖中的作用。将蔗糖降解为葡萄糖和果糖的三种转化酶候选物也表现出相似的情况，编码蔗糖－质子同向转运体的CqSUT转录水平上调，因为蔗糖参与其他正常能量供应的过程和功能，表明蔗糖的输出在种子萌发开始时也被激活。通过 qRT-PCR 分析进一步证实了 CqBAM3 ( AUR62007199 ) 、CqINVB ( AUR62041914 )、CqFRK4 ( AUR62023862 ) 和CqSUT1 ( AUR62004667 ）转录水平的增加与组学表达数据一致，整体结果表明，在藜麦种子萌发的早期阶段，淀粉和蔗糖代谢提供了主要能量。
04.细胞壁的重塑和修饰在种子萌发过程中十分重要
通过GO分析进一步研究藜麦种子萌发过程中发生的分子动力学，细胞壁重构相关过程包括生物过程组中的“葡聚糖代谢过程”和“细胞葡聚糖代谢过程”，以及分子功能组中的“木葡聚糖－木葡糖基转移酶活性”和“转移酶活性”，以及细胞成分组中的“细胞壁”显着富集。植物细胞壁由复杂的基质组成，包括纤维素、葡聚糖、半纤维素和果胶，它们提供了细胞和组织的机械性能。此外，初生壁控制细胞生长并有助于其高碳固定的能量代谢，因此细胞壁通过降解、重组和修饰进行再循环在种子萌发等快速生长期间十分重要。
为了更好地验证藜麦种子萌发过程中细胞壁重塑的分子调控，作者检查了参与多个过程的 DEG，包括在原代细胞壁降解中起作用的基因。有已被表征为拟南芥中参与木葡聚糖降解相关酶，同时与果胶降解相关的DEG ，包括编码果胶甲基酯酶 ( PME )、果胶甲基酯酶抑制剂 ( PMEI ) 和果胶裂解酶 ( PEL ) 的基因均在阶段 II后立即显着上调。此外，与细胞木葡聚糖代谢相关的基因，如木葡聚糖水解酶、木葡聚糖内转糖基酶和木葡聚糖在胚根出现的间隔内高表达，催化半纤维素中木葡聚糖链的重塑和动员，削弱纤维素微纤维，促进自由基突出。 编码UDP－糖基转移酶（CqUGTs）的基因，通过以核苷酸糖作为单糖供体催化糖苷键的形成，促进细胞壁多糖的合成，在胚根出现的间隔内也显着富集。转录组的结果表明，细胞壁重塑过程非常活跃，有助于早期种子萌发的快速转变。
代谢组学分析显示细胞壁糖在种子萌发过程中增加，例如岩藻糖、半乳糖和木糖。这些代谢物的动态变化表明，细胞壁重塑途径的激活不仅加速了细胞壁的构建，而且还参与了与能量代谢和多种初级和次级代谢相关的代谢循环.
05.下胚轴伸长阶段后，光合作用过程被高度激活
聚类和 KEGG 富集分析表明，“光合作用蛋白”、“光合作用－天线蛋白”、“光合作用”和“光合生物中的固碳”等通路条目的富集情况在胚根出现（阶段 III）到下胚轴伸长（阶段 IV）直至在最后的子叶消耗阶段均有。
在卡尔文循环反应中被注释为功能成分的 DEG 在最后阶段表现出高度表达表明随后的藜麦生长不仅取决于储存储备物质的动员，还取决于光合作用。然而，参与该过程的大多数基因的转录水平在 III 期和 IV 期之间表现出显着差异，表明光合作用的激活可能发生在紧随胚根出现的阶段。作者选取了6个参与光合作用的基因进行qRT-PCR分析，这些基因在幼苗期与之前的阶段相比显著增加，表明光合作用对藜麦发芽后幼苗的生长起关键作用。
06.氨基酸的动态代谢随着种子萌发的完成而发生
最后作者对于各阶段下的氨基酸动态代谢聚类发现，赖氨酸和组氨酸在下胚轴伸长阶段显着积累。此外，大多数其他氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，在子叶扩张阶段显著增加，这是在幼苗快速发育过程中蛋白质生物合成所必需的。GABA作为一种非蛋白质氨基酸，广泛参与信号转导或调控途径，在植物的非胁迫和胁迫条件下发挥多种功能。作者分析了 GABA 的含量，发现它在最终阶段显着积累，而在早期阶段没有差异。然后分析了与 GABA 代谢相关的 DEG，结果表明，GABA可能在藜麦发芽和育苗过渡中发挥重要作用。
总结
作者从藜麦干种子到幼苗的过渡过程中分五个阶段进行了转录组学研究。结合代谢组分析，发现种子代谢在胚根伸长过程中随着多种植物激素（尤其是脱落酸）和其他营养物质的显着改变而改变。细胞壁重构是藜麦种子萌发早期的另一个主要活动过程。光合作用在最后阶段完全激活，促进氨基酸和蛋白质的生物合成，使幼苗生长。多组学分析揭示了藜麦种子萌发过程中代谢途径和表型的全面变化。