类器官是体外培养的由干细胞分化而来的后裔细胞所形成的具有一定空间结构的三维细胞复合体。类器官具有某些与来源器官相似的结构特征和功能特性，而且能够在体外3D培养体系中稳定扩增。目前，类器官在生物学基础研究，构建疾病模型、肿瘤研究、组织再生修复、基因治疗以及药物筛选等方面显示出了广阔的应用前景。接下来分享两篇青莲客户的应用案例，利用蛋白质组学技术揭示类器官模型在疾病病理机制、疾病治疗中的重要应用价值。
案例一
hiPSC衍生的皮肤类器官揭示SARS-CoV-2感染的病理生理学特征
新冠病毒可以直接攻击或间接影响肺、气管、肠、肾、脑、心脏和皮肤等多个器官。在新冠病毒大流行期间，多种人类多能干细胞（ESC/hiPSC）衍生的类器官已被用来建立体外感染模型来研究病毒和宿主的相互作用机制，并进行有效的药物筛选。2022年03月04日，由中国医学科学院北京协和医院、蛋白质科学中心（北京）、中科院武汉病毒所以及华中科技大学同济医学院的研究团队联合发表了题为“Establishment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Skin Organoids Enabled Pathophysiological Model of SARS-CoV-2 Infection”的研究论文，且该论文作为该期Advanced Science杂志（IF：16.806）的封面文章刊登。该研究建立了COVID-19患者皮肤的蛋白质组图谱，并研究了人类诱导的多能干细胞（hiPSC）衍生的具有毛囊和神经系统的皮肤类器官对SARS-CoV-2感染的敏感性。发现新冠病毒能够感染皮肤毛囊干细胞和神经系统，从而导致毛发脱落和神经元死亡。该研究首次为新冠肺炎和脱发后遗症之间的关联提供了证据，也展现了皮肤类器官在病理机制研究和药物筛选方面的巨大潜力和价值（青莲百奥承担了质谱相关数据的产出）。
临床COVID-19皮肤样本的综合蛋白质组学概况
该研究首先通过病理染色和电镜在新冠患者皮肤组织中发现了SARS-CoV-2病毒颗粒的存在，证实了新冠病毒能够直接感染皮肤组织。进而，通过定量蛋白质组学的方法构建了新冠患者皮肤的蛋白质组学图谱，并发现了表皮发育、神经系统、血液循环系统、和包括细胞外基质、焦点黏连、桥粒、黑素小体等多处皮肤重要组织微环境的生物学过程受到了严重影响。
hiPSC衍生的皮肤类器官的建立
研究团队使用hiPSC构建了皮肤类器官模型。为了进一步证明皮肤类器官类似于人体皮肤组织的生理功能，对培养后第140天建立的成熟皮肤类器官进行蛋白质组学特征分析。结果显示，在这些器官中鉴定出的蛋白质主要富集在表皮细胞、神经细胞、基质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞和血管相关细胞中（图2a）。生物过程分析表明，从皮肤类器官中鉴定出的蛋白质主要富集在表皮发育、神经系统发育和干细胞分裂等皮肤发育过程中（图2b）。在皮肤类器官中发现了几种信号通路，包括经典和非经典Wnt、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子（FGF）以及与皮肤发育相关的TGF β和TGFg。特别是，在皮肤类器官中发现了与表皮发育相关的蛋白质，这些蛋白质参与了皮肤屏障（例如KRT1和KRT16）、上皮细胞分化（例如KRT14和KRT4）和黑素体的建立过程（图2c）。此外，还鉴定到了核心ECM蛋白，如15种胶原蛋白、31种糖蛋白和10种蛋白聚糖以及多种重要的生长因子。这些结果表明，作者已成功构建了具有多种结构和细胞功能的皮肤类器官。
SARS-CoV-2可以感染毛囊和皮肤的神经系统
接下来通过SARS-CoV-2体外感染皮肤类器官，发现SARS-CoV-2主要靶向KRT17+毛囊细胞，对KRT71+和PDGFRα+毛囊细胞靶向作用较少。SARS-CoV-2感染导致类器官中KRT17 +毛囊周围表皮细胞的上皮形态消失，细胞增殖能力下降，研究发现该现象是由于SARS-CoV-2感染使得毛囊周围表皮细胞核的H2A.X磷酸化而导致双链DNA断裂，从而引起DNA损伤和氧化应激而损伤毛囊干细胞。进一步研究发现，毛囊周围的神经元细胞和雪旺样细胞相继被感染，而神经内分泌细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、卫星细胞等多种神经细胞类型的细胞形态和功能蛋白均受到严重影响。
总结
该研究利用COVID-19的皮肤样本以及体外类器官感染模型揭示了SARS-CoV-2能够直接感染皮肤的毛囊和神经系统以及SARS-CoV-2感染导致的皮肤不同结构病变的致病机制。为后续研究COVID-19患者皮肤的SARS-CoV-2感染机制和药物筛选提供了指导。
案例二
iPSC衍生的类器官模型在局限性硬皮病治疗中的应用
局限性硬皮病（LoS）是一种罕见的慢性疾病，具有广泛的组织纤维化、炎性浸润、微血管改变和表皮附件病变特征。然而，目前对LoS的发病机制和治疗策略的深入了解是有限的。2022年03月22日，由中国医学科学院北京协和医院、蛋白质科学中心（北京）、应急防控药物工程技术研究中心研究团队在Advanced Science杂志（IF：16.806）上联合发表了题为“Application of an iPSC-Derived Organoid Model for Localized Scleroderma Therapy”的研究论文。该研究建立了LoS皮肤的蛋白质组图谱，并对LoS皮肤的病理特征进行了表征。然后创建了人源诱导的多能干细胞来源的上皮和间充质（EM）类器官模型对LoS小鼠进行类器官移植治疗，发现该策略可以显著减轻皮肤纤维化的程度，增强皮肤中表皮干细胞的活性，并促进汗腺和血管的再生。这些结果突出了EM类器官模型在促进硬皮病相关表型和皮肤相关功能恢复方面的潜在应用（青莲承担了类器官蛋白质组质谱数据的产出）。
通过注射博莱霉素1个月建立局限性硬皮病（LoS）小鼠模型。使用定量蛋白质组学方法分析硬皮病皮肤组织的病理特征，结果显示硬皮病小鼠皮肤微环境调节因子显著失调。接下来应用iPSC生成EM类器官。并对第16天的EM类器官进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和质谱分析，结果显示研究者已成功构建了由MSCs、上皮细胞和神经样细胞类型组成的具有不同细胞功能的EM类器官。接下来，应用EM类器官对硬皮病小鼠进行移植治疗。蛋白质组学分析显示，共有614个蛋白质在治疗组和硬皮病组之间差异表达（图4a）。进一步分析集中在硬皮病中差异表达，经类器官治疗后表现出恢复表达的蛋白（图4b）。这些蛋白质在肌肉收缩和发育、肌原纤维组装和ATP代谢的生物过程中高度富集，表明EM类器官治疗有效地改善了肌肉纤维化（图4c）。病理染色也显示，经EM类器官治疗后，硬皮病小鼠皮肤组织中纤维化标志物（α-SMA、VIM和EN1）的表达显著下调（图4d，e）。此外，治疗后炎症相关细胞因子表达水平显著下调。这些结果表明，EM类器官可以改善硬皮病小鼠的皮肤纤维化和炎症反应。进一步免疫荧光染色还显示了EM类器官处理的硬皮病小鼠皮肤中出现汗腺再生（图4f），以及表层受损血管的明显再生（图4g）。
总结