摘要：Monolith分子互作仪检测超大复合物蛋白酶体26S与去泛素化酶USP14之间相互作用。
4月27日，北京大学毛有东教授团队在Nature杂志在线发表了文章“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”。通过时间分辨冷冻电镜技术，揭示了与去泛素化酶动态调控人源蛋白酶体（proteasome）的机制。
背景
在真核细胞中，蛋白质降解是一项极其重要的生物化学过程，对细胞周期及分子功能都发挥关键调控作用。泛素-蛋白酶体系是蛋白质降解的一种主要方式。据报道，蛋白酶体功能紊乱，与癌症、神经退行性疾病、免疫疾病等一系列人类疾病有关。
去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶体调控分子，因此它被认为是一个潜力巨大的癌症和神经退行性疾病的靶标。USP14通过可逆结合蛋白酶体26S被激活，剪切底物上的泛素链，然而这一过程速度极快，时间尺度在毫秒到秒之间。因此USP14被蛋白酶体激活并调控蛋白酶体功能的机制，一直是个世界级的科研目标。
研究方法及结果
为了阐明USP14与蛋白酶体26S之间的调控机制，毛有东研究团队通过大量的条件摸索，优化出一套时间分辨冷冻电镜技术的实验方案。最终获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，挑取了超过300万个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像。
接下来，研究团队利用自主开发的人工智能高精度三维分类四维重建技术，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物过程的13种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡构象，通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期。
在阐述USP14被蛋白酶体26S激活的机制的过程中，研究团队利用Monolith分子互作仪检测了有底物和无底物的条件下，蛋白酶体26S与USP14的相互作用。结果表明，蛋白酶体与全长USP14在底物Ubn-Sic1PY存在下时，解离常数为43.9 nM（图2 o），是无底物存在时（图2 l）的一半。蛋白酶体与UBL结构域 (图2 m)或 USP结构域（图2 n）的亲和力更低，解离常数分别为137 nM和 135 nM。由此验证了蛋白酶体与USP14及其UBL和USP结构域的相互作用，并且在底物存在时，亲和力增强。
结论
这项突破性的研究阐明了USP14和26S相互调控活性的原子级结构基础和非平衡动力学机制，为USP14靶向药物分子的开发和临床应用奠定了基础。
《Nature》同期发表的专栏推介文章中，审稿人评价 “该工作是一项重大研究，终于在原子水平解决了USP14活化和其调控蛋白酶体功能的机制问题” 。
Monolith在本项研究中突显的优势
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检测大分子vs超大复合物 (USP14 ~65kDa，蛋白酶体26S ~3000 kDa)
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溶液体系中轻松检测三元互作，验证了底物对于USP14-proteasome亲和力的影响
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精确检测nM级解离常数，用于比较USP14不同结构域和蛋白酶体26S的亲和力大小
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仪器操作简单，无需繁琐的清洗维护