万没想到，新冠还能跟m6A结合，基于m6A甲基化的免疫调节背景，结合生信免疫浸润分析模块，不仅可以量化免疫细胞亚型的丰度，还可以利用免疫检查点、免疫细胞表型等热点丰富结果，跟小编一起来看看文献是如何分析的吧
Frontiers in immunology （ IF: 7.561）
m6A调控因子介导的COVID-19患者血白细胞免疫甲基化修饰模式及特点
研究背景
最近的研究揭示了宿主细胞和SARS-CoV-2中m6A修饰的改变。与健康个体相比，COVID-19患者肺组织中METTL3和METTL14基因表达显著下调，而大部分炎症基因和胰岛素刺激基因(ISGs)表达水平升高。SARS-CoV-2病毒利用宿主METTL3修饰病毒RNA并逃避宿主细胞免疫应答，SARS-CoV-2感染也被发现触发m6A修饰机制重新定位并增强Vero和Huh7细胞中mA的丰度。尽管这些发现提供了宿主细胞和SARS-CoV-2之间m6A甲基组相互作用的证据，但目前的研究主要集中在几个m6A相关基因，几乎所有的研究都是使用模型细胞，如Caco2和Huh7，这可能不能充分反映SARS-CoV-2感染患者免疫细胞中甲基化修饰的实际情况。因此，迫切需要探索的免疫细胞中的甲基修饰谱和m6A修饰与免疫功能之间的相互作用。
分析流程图
数据来源
基于GEO数据库（GSE157103）中126份样本的RNA-seq，包括100例COVID-19患者和26例非COVID-19患者。获得的临床信息包括年龄、糖尿病状态、ICU状态和第45天无住院天数(HFD45)。HFD45为住院时间超过45天或住院时死亡的患者分配0值，较高的HFD45值分配给住院时间较短和疾病严重程度较轻的患者。
COVID-19 患者m6A调节分子表达
分析20 m6A基因在COVID-1患者和非COVID-1患者之间的表达，可以看到所有m6a调节因子在COVID-19患者中的表达水平均显著上调；为了探索不同的m6a调节器之间的关联，描述了三种类型的m6a调节器之间的关联模式
COVID-19 患者免疫及富集分析
分别使用R中的“GSVA”、“clusterProfiler”包进行富集分析，评估COVID-19患者与非COVID-19患者之间的生物功能；为了确定COVID-19和非COVID-19患者组之间的免疫系统是否发生改变， 通过“CIBERSORT”的细胞类型识别来确定的22个免疫细胞类型之间的两组之间免疫细胞的丰度差异。
使用m6A分子进行一致性聚类，确定两种m6A调控模式
使用由“ConsensusClusterPlus”包执行的无监督聚类算法，根据20个基因m6A基因将COVID-19患者划分为不同的亚型，并比较感染新冠患者亚组之间这20个基因表达存在差异；找到显著表达差异的m6A调节基因
m6A调控亚型临床指标及新冠患者预后相关的基因差异情况
比较不同亚组之间的住院时间HFD45，提示亚组A住院时间更短；比较亚组A和亚组B之间，新冠患者预后相关的基因（既往文献报道）的表达差异情况
m6A亚型GSVA通路差异分析
GSVA分析揭示了亚型间存在代谢和免疫反应中经典途径和不同生物学过程的激活。
通过LASSO回归构建m6A相关的保护模型
不同m6A簇之间、COVID-19患者与非COVID-19患者之间差异比较，共得到4565个共有差异表达基因。我们利用“glmnet”软件包，在这些deg的基础上构建了患者队列中的LASSO模型，通过lasso回归筛选出9个候选基因。这些患者被分为两组:训练队列包括70%的患者，而验证队列包括30%的患者。在训练队列中构建的模型在验证队列中进行了验证。采用R包“plotROC”绘制AUC评分的受试者工作特征(ROC)曲线，评价模型的性能。
模型评分与各种临床指标相关性分析
模型基因富集及保护评分与临床信息的相关性，通过模型对本研究的患者进行打分，发现高低分组之间临床指标存在差异（赋予模型临床意义）；保护评分与HFD45、无呼吸机天数呈正相关，与SOFA评分、APACHE-II评分、crp呈负相关。保护评分与HFD45评分(B)、SOFA评分(C)、APACHE-II评分(D)、crp (E)、无呼吸机天数(F)的相关性。
小结
本文以m6a相关分子为切入点对新冠患者进行了细致的分析，首先发现m6A甲基化调控的3类基因在感染和未感染新冠患者血液芯片测序数据的表达水平存在差异。免疫浸润分析发现新冠患者的血液中特殊亚群免疫细胞的丰度存在异常状态。GSVA分析发现患者与对照组的信号通路存在差异。通过无监督聚类将新冠患者分为两个亚群，亚群之间存在不同的免疫差异。最后，将患者与非患者的差异基因和亚群之间的差异基因取交集，构建lasso回归预测模型，模型具有良好的诊断效能。
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