近年来，干细胞外泌体载药治疗关节炎吸引了很多该研究领域的大家们注意。外泌体因为能在细胞间穿梭，有利于细胞间物质与信息的交换，其可以通过装载外来药物来改变受体细胞功能状态。外泌体载药系统的发现解决了部分溶解度差、副作用大的药物不能在临床使用的问题。今天小编就带来一篇“Chitosan oligosaccharides packaged into rat adipose mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles facilitating cartilage injury repair and alleviating osteoarthritis”AMSCs衍生的外泌体载壳寡糖治疗骨关节炎的新思路，影响因子为10.435，发表在Nanobiotechnology杂志上，发表时间为2021年10月，该文章主要探究了脂肪间充质干细胞（AMSC）衍生的细胞外囊泡（EV）与壳寡糖（COS）结合在软骨损伤中的作用及其相关机制。接下来通过作者得到的实验结果来分析这篇文章吧！
1. 鉴定大鼠 AMSCs 衍生的 EVs、EVs-COS
为了确定用于进一步实验的 EV 和 COS 的最佳浓度，用不同浓度的 EV 和 COS 处理软骨细胞 48 小时，然后确定它们的活力。如图1所示：与未处理的细胞相比，暴露于5、10、20和50 μg/mL EV处理后 的细胞活力显着增加（P < 0.05），并且在用 20 μg/mL EV 处理的细胞活力最高。另外，40、80、160、320、640、1280 μg/mL COS 处理细胞活力显着增强（P < 0.05），320 μg/mL COS处理细胞活力最高。基于这些结果，选择 20 μg/mL EVs 和 320 μg/mL COS 用于后续实验。
从大鼠 AMSC 中分离的 EV 使用 TEM、NTA 和蛋白质印迹进行表征。TEM 显示提取的物质呈杯状或近圆形，直径约 100 nm。NTA结果显示分离物质的主峰约为120 nm，平均峰为133.9 ± 0.8 nm。此外，Western blot结果表明，作为EV标志物的CD3、TSG101和CD9均在EV中表达，而calnexin仅在细胞中表达。这些结果表明 EV 从大鼠 AMSC 中成功分离。COS与EVs结合后，作者分别用TEM和NTA观察细胞外囊泡-壳聚糖寡糖偶联物（EVs-COS）的形态并测定其大小。EVs-COS 的形态接近圆形，直径约为100 nm。NTA 结果显示 EVs-COS 的主峰为139 nm，平均峰为183.4 ± 1.5 nm，这表明 EVs-COS 的尺寸大于 EVs 的尺寸（如图2所示）。
结论：EV 从大鼠 AMSC 中成功分离，并且EV可与COS实现结合
2. EVs-COS增强IL-1β诱导的软骨细胞损伤细胞活力，降低细胞凋亡
为了了解EVs-COS对软骨损伤修复的影响，作者使用IL-1β建立软骨细胞损伤模型。在培养24、48 和 72 小时后，测量了细胞活力和细胞凋亡。结果表明，与对照组相比，IL-1β组的细胞活力显著受到抑制。24 h后IL-1β组和IL-1β+COS组细胞活力无显著差异。与IL-1β组相比，IL-1β+EVs和IL-1β+EVs-COS组的细胞活力显著增加。培养48、72 h后，IL-1β+COS、IL-1β+EVs和IL-1β+EVs-COS组细胞活力较IL-1β组显著增强。同时，IL-1β+EVs-COS组的细胞活力比IL-1β+COS组的细胞活力增强更显著。培养48 h或72 h后，IL-1β+EVs-COS组的细胞活力也显著高于IL-1β+EVs组。基于这些结果，选择处理 48 小时的软骨细胞进行后续实验。
流式细胞术用于确定不同处理方法处理的软骨细胞中的细胞凋亡情况。对照组和IL-1β组细胞凋亡率分别为2.99±0.08%和21.26±1.11%，与对照组相比，IL-1β组细胞凋亡率显著增加。然而，当用 COS、EVs 和 EVs-COS 处理 IL-1β 诱导的软骨细胞时，细胞凋亡率分别降低至 9.12 ± 0.49%、7.64 ± 0.37% 和 6.94 ± 0.34%。此外，IL-1β+EVs-COS组的细胞凋亡率显著低于IL-1β+COS组（如图3所示）。
结论：IL-1β可以显著抑制软骨细胞的活力并促进细胞凋亡，而EVs-COS可以逆转IL-1β诱导的细胞活力和凋亡的变化。此外，EVs-COS的细胞活力和细胞凋亡变化高于COS。
3. EVs-COS促进 IL-1β 诱导的软骨细胞迁移
作者使用 Transwell 和划痕实验进一步研究了 EVs-COS 在 IL-1β 诱导的软骨细胞迁移中的作用。Transwell 结果显示，与对照组相比，IL-1β 显著减少细胞数量，而 COS、EVs 和 EVs-COS 明显增加了 IL-1β 诱导的细胞数量减少。IL-1β+EVs-COS组细胞数显著高于IL-1β+COS组。划痕实验的结果与 Transwell 实验的结果相似（如图4所示）。
结论：IL-1β 可以抑制软骨细胞迁移，而 EVs-COS 促进由 IL-1β 引起的软骨细胞低迁移。
4. EVs-COS影响软骨细胞功能的分子机制研究
为了探索潜在的分子机制，使用 RT-qPCR 和Western blot确定了 IL-1β、COL1A1、COL2A1、OCN和RUNX2、Akt1 和 PI3K 等相关基因的表达水平。与对照组相比，IL-1β被IL-1β诱导显著上调。COS和EVs-COS治疗组可以逆转IL-1β诱导的显著上调趋势，并且EVs-COS 的作用高于COS；IL-1β组COL1A1和COL2A1的mRNA表达明显下调；而与IL-1β 组比较，IL-1β+COS、IL-1β+EVs、IL-1β+EVs-COS组中COL1A1和COL2A1 mRNA表达明显上调；与对照组相比，IL-1β组中OCN和RUNX2的mRNA表达显著降低，而COS，EVs和EVs-COS的处理可以恢复其表达。Akt1 和 PI3K 的 mRNA 表达与OCN mRNA 的表达相似。此外，与对照组相比，IL-1β诱导后c-Myc mRNA表达显著下调，而COS、EVs和EVs-COS处理组中c-Myc mRNA表达显著增加。然而，p53 mRNA表达的趋势与c-Myc表达的趋势相反。与对照组相比，IL-1β组p-Akt/Akt水平显著下调，而COS、EVs和EVs-COS治疗后，其水平显著上调（P < 0.05），EVs-COS 的效果优于 COS（如图5所示）。
结论：EVs-COS 可以通过调节软骨细胞特异性基因（COL1A1 和 COL2A1）、成骨细胞相关基因（OCN和 RUNX2）来影响软骨细胞的活力、凋亡和迁移，凋亡相关基因（c-Myc和p53 ）和 Akt/PI3K 通路，从而改善软骨损伤修复和OA。
5. EVs-COS对软骨组织损伤具有缓解作用，可治疗软骨组织损伤
通过软骨组织的HE染色进一步研究从对照组、损伤模型、COS、EVs和EVs-COS组大鼠中分离的软骨组织，以及与大鼠软骨损伤和EVs-COS治疗相关的组织学变化。对照组显示正常软骨组织，无炎性细胞因子浸润。造模后模型组软骨组织损伤肿胀，软骨基质变性，炎性细胞因子浸润（如图6所示）。结果表明，COS、EVs和EVs-COS组软骨组织损伤得到缓解，EVs-COS对软骨组织损伤有较好的治疗效果。
结论：EVs-COS 促进软骨损伤修复和改善 OA。
6. 相同表达模式中DEGs的筛选和功能分析
经比较，COS与模型组之间、EVs-COS与模型组之间、EVs-COS与COS组之间共鉴定出2091、503和412个DEG。通过比较COS与模型、EVs-COS与模型、EVs-COS与COS 之间的DEG，并在至少两个对照组中保留DEG，获得760个DEG用于进一步的表达趋势聚类分析。随后利用Mfuzz算法对得到的760个DEGs的表达模式进行分析，观察不同处理下目的基因的表达趋势。四个表达模式，簇1、2、3 和 4被聚类，同时，对于每个集群中的DEG做BP和KEGG富集分析。发现簇1中的 DEGs 在同种异体移植排斥、调节干细胞多能性的信号通路、吞噬体、经典Wnt信号通路（SFRP5、SOX9和GLI1）的负调节、细胞对转化生长因子β刺激的反应中显著富集、细胞增殖的调节和软骨凝聚。簇2中的DEGs与ECM-受体相互作用、粘着斑、PI3K-Akt信号通路（COL1A1、COL3A1、ITGA4、BAD和FOXO3）和蛋白水解密切相关。同时，簇3中的DEGs 参与心肌细胞的肾上腺素能信号、AMPK信号通路（PPP2R3A、CPT1B和ACACB）以及钾离子转运的正调节。最后，簇4中的DEGs在调节肌动蛋白细胞骨架、MAPK 信号通路（CACNA1S、CACNG1和MAPK12）、磷酸戊糖通路、肌节组织、肌肉收缩、骨骼肌组织发育和肌原纤维组装中发挥重要作用（如图7所示）。
结论：EVs-COS可以通过对经典Wnt、PI3K-Akt、AMPK 和 MAPK 信号通路的负调节来促进软骨损伤修复和缓解 OA
文章总结：作者对脂肪间充质干细胞（AMSC）衍生的细胞外囊泡（EVs）与壳寡糖（COS）结合是否可以治疗骨关节炎软骨损伤进行了功能研究和机制探索。作者首先以IL-1β诱导的软骨损伤细胞模型和EVs-COS结合治疗入手，证明了IL-1β处理显著抑制软骨细胞的活力和迁移，增强细胞凋亡，而EVs-COS则逆转IL-1β诱导的变化，EVs-COS的作用优于COS。然后通过RT-qPCR和Western blot方法观察到软骨损伤后相关基因和蛋白的变化。随后通过测序手段分析了EVs-COS参与的信号通路，得出聚集成四种表达模式的760个差异表达基因(DEG)与经典Wnt、PI3K-Akt、AMPK和MAPK信号通路的负调控相关。纵览全文，作者通过构建的体内和体外大鼠软骨损伤模型，系统地研究了包装到大鼠AMSC-EV中的低分子壳寡糖（COS）对软骨损伤的影响和相关机制，这些发现为治疗基于软骨损伤的OA和其他退行性关节疾病的药物开发提供了新的见解和策略。
延伸思路：对于通过测序手段分析的差异基因及其调控的信号通路本文并未设计实验进行验证，在分子机制方面可从这个角度进行进一步的研究和探索。
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文献来源：Li S, Liu J, Liu S, Jiao W, Wang X. Chitosan oligosaccharides packaged into rat adipose mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles facilitating cartilage injury repair and alleviating osteoarthritis. J Nanobiotechnology. 2021 Oct 26;19(1):343.