癌症相关成纤维细胞 (CAF)是肿瘤微环境（TME）最丰富的基质细胞之一，在肿瘤细胞侵袭，肿瘤干细胞更新，化疗耐药和免疫细胞逃避过程中发挥重要作用，是肿瘤治疗的重要靶标。但CAF是个异质细胞群，为了确保精确靶向肿瘤的 CAF，我们需要通过识别特定标记更好地表征 CAF 异质性。单细胞测序无疑是表征肿瘤异质性的好方法，但测序样本要求比较高，费用较高也让一些研究者望而却步。那有什么替代方法吗？当然有，本次就给大家推荐一个利用单细胞公共数据的纯生信发文思路，站在巨人的肩膀上轻松发文10分+！
文章题目：Implication of cancer associated fibroblast subtypes on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance（癌症相关成纤维细胞亚型对癌症发病机制、预后和免疫治疗耐药的影响）
研究背景
CAFs可以促进肿瘤细胞侵袭，肿瘤干细胞特性，化疗耐药和免疫细胞逃避等；然而，在某些癌症类型中，CAFs 还可以在 TME 中发挥肿瘤抑制作用。为了确保精确靶向促进肿瘤的 CAF，我们需要通过识别特定标记更好地表征 CAF 异质性。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 已经揭示了一系列癌症类型的恶性和/或基质细胞异质性，但是不同癌症类型的 CAF 子集是否以及如何共享相似的基因表达谱和分子功能尚不清楚，CAF 亚型的临床关联及其与免疫疗法耐药性的关系仍有待确定。因此，作者对来自黑色素瘤 (MEL)、头颈部鳞状细胞癌 (HNSC) 和肺癌 (LC) 的 CAF 进行了综合分析，并确定了在每个 CAF 亚型中明显活跃的分子特征。鉴定了个体 CAF 亚型的基因特征，并用于研究亚型丰度与临床结果和免疫治疗耐药性的关联。
研究流程
主要结果
1. Pan-CAF亚型的鉴定和分子表征
综合数据的高分辨率聚类确定了七个 CAF 亚型（图2A)，称为Pan-CAF 1-7。这些泛CAF亚型存在于三种癌症类型中，但丰度不同（图2B)。
> Pan-CAF 1 由 1007 个细胞组成（占所有 CAF 的 53.8%，红色），并根据激活的成纤维细胞标志物 ( ACTA2 ) 和平滑肌细胞标志物 ( MYH11、MCAM、TAGLN和MYLK ) 的表达升高被归类为Pan-myCAF，GO 分析显示与平滑肌收缩和血管伤口愈合相关的基因集富集；
> Pan-CAF 2 包含 815 个细胞（28.3%，棕色）并根据编码胶原蛋白的基因（COL1A1、COL3A1等），和GO分析中与细胞外基质 (ECM) 重塑的相关的基因富集而被归类为Pan-dCAF
> Pan-CAF 3 由 588 个细胞（20.5%，深绿色）组成，基于CFD、C3、CXCL14和CXCL12 的高表达和GO分析富集于炎症，被表征为 pan-iCAF；
> Pan-CAF 4，包含 202 个细胞（7.0%，浅绿色）被归类为 pan-iCAFs-2，具有高且独特的炎症相关基因表达，包括CXCL2。GO 分析发现基因在 NF-kB 信号通路富集；
> Pan-CAF 5 包含 158 个细胞（5.5%，蓝色），因为其体内平衡标记基因的富集，被归类为正常成纤维细胞（pan-nCAF）；
> Pan-CAF 6 由 69 个细胞 (2.4%) 组成，代表低质量细胞簇 (LQ-CAF)，没有可检测的标记基因，因此被排除在进一步分析之外；
> Pan-CAF 7，由 34 个细胞 （1.2%, 粉红色），由于与细胞周期相关的基因（BIRC5、TOP2A等）表达升高，以及与细胞增殖相关基因的富集，而被归类为 pan-pCAF 。Seurat 的细胞周期分析还表明，该簇富含与细胞周期 S 期相关的基因（图2E）。
进一步注释 pan-CAF 的表型和功能异质性，分析表明，pan-myCAFs 表达一组不同的胶原蛋白（COL4A1、COL4A2等）、参与血管生成的基因（EGFL6、ANGPT2和PDGFA）、平滑肌相关的收缩基因和 RAS 超家族成员。Pan-dCAFs 表达一组不同的胶原蛋白（COL1A1、COL7A1、COL10A1等）、MMP、TGFB 信号分子和 ECM 相关基因。pan-iCAFs和pan-iCAFs-2的胶原基因表达低，但促炎分子表达高。具体而言，pan-iCAFs 高表达促炎和免疫抑制因子 IL-33、CXCL12 和 CXCL14，而 pan-iCAFs-2 高表达 CXCL1-3、CCL2、IL-6 和 IL-7（图2F）。这些结果突出了 pan-CAF 亚型之间的相似性和差异，以及每种 CAF 亚型可能产生的相关细胞因子和免疫因子，用于介导其与其他 TME 或肿瘤细胞的特定相互作用。
最后，为了为未来pan-CAF 亚型的实验鉴定和分离提供一个框架，作者使用细胞表面蛋白质图谱数据库鉴定了在细胞膜表面产生蛋白质的标记基因（图 2G）。
2. Pan-CAF 亚型特异性转录因子和基因调控网络
作者接下来确定转录因子 (TF) 及其靶向基因调控网络，以便更好地了解Pan-CAF 亚型是如何在遗传上建立和维持的。为此，应用软件 SCENIC 来识别在一种Pan-CAF 亚型与其他亚型中高度活跃的 TF 及其靶基因（图3）。
Pan-myCAF 富含MEF2C，调节新血管生成，MEF2C 的靶基因如MYLK、ACTA2等在 pan-myCAFs 中均上调（图3A, B）；
TWIST1是 pan-dCAF 中表达最高的 TF 之一，它是 CAF 转分化的关键因素。此外，TWIST1 的靶基因（TWIST2、COL1A1、MMP2等）在 pan-dCAF 中均上调（图3A, C）；
Pan-iCAFs和Pan-iCAFs-2显示出高表达NR1H3，可以控制与炎症相关的转录程序。NR1H3 的靶基因（IL-33、CXCL14、CXCL12等）在 pan-iCAF 中均上调。除了NR1H3，pan-iCAFs-2 还显示出NF-kB亚基RELB 的高表达，这是一种已知的参与促进炎症转录程序的辅助因子。此外，RELB 目标促炎基因（CXCL2、TNFAIP3等）在 Pan-iCAFs-2 中上调（图3A, D, E）；
Pan-pCAF 显示出FOXM1 的高表达，这与细胞增殖有关 ，已知的FOXM1循环调控靶基因（BIRC5、CDK1等）在 pan-pCAFs 中上调（图3A, F）。
3. Pan-CAF亚型特异性基因特征预后效用的泛癌评估
作者试图评估癌症类型和起源组织如何影响肿瘤的 CAF 亚型以及已识别的Pan-CAF 亚型的促肿瘤发生和抗肿瘤发生特性。为了解决这个问题，作者策划了Pan-CAF 亚型特异性基因特征，并使用它们来评估TCGA 中获得的 31 种癌症类型的Pan-CAF 丰度，并以特征基因的更高表达代表Pan-CAF 亚型的高丰度，以此特征评估Pan-CAF 亚型的预后效用。
结果显示，pan-myCAFs 特征基因的高表达与膀胱尿路上皮癌 (BLCA) 的不良预后相关，表明 pan-myCAFs 可能在 BLCA TME 中具有促肿瘤作用（图4A）。pan-dCAF基因特征的高表达与胃腺癌（STAD）、肾透明细胞癌 (KIRC)的不良预后相关（图4B, C），pan-iCAFs 特征基因的高表达与 LGG 的不良预后相关。iCAFs-2 基因的高表达与 LGG 的不良预后相关（图4D），与皮肤黑色素瘤（SKCM）的良好临床结果相关（图4E）。pan-pCAF 基因的高表达与包括 MESO 在内的几种癌症类型的不良预后相关（图4F）。
单个pan-CAF 基因特征的风险比 (HR) 的分层聚类表明 TCGA 肿瘤可分为三组。第一组由大多数pan-CAF 亚型与不良预后密切相关的肿瘤类型组成：MESO、肾上腺皮质癌 (ACC)、KICH等；第二组由大多数 pan-CAF 亚型与预后中度至无关的肿瘤类型组成：子宫癌肉瘤 (UCS)、食管癌 (ESCA)、 结肠腺癌 (COAD), 肺鳞状细胞癌 (LUSC), 直肠腺癌 (READ), 肺腺癌 (LUAD等；最后一组由大多数pan-CAF亚型与良好预后相关的肿瘤类型组成：前列腺腺癌（PRAD）和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）（图4G）。
这些结果表明癌症类型和起源组织如何塑造 CAF 亚型，并提供洞察哪些pan-CAF 亚型可能有助于特定癌症类型的肿瘤促进或肿瘤抑制作用。
4. Pan-CAF亚型与肿瘤中特定分子功能的关联
由于观察到单个Pan-CAF 亚型与特定癌症类型的不良预后相关，因此作者试图确定在Pan-CAF 亚型丰度更高的肿瘤中失调的分子途径。应用了排序基因集富集分析（rGSEA）Pan-CAF亚型与预后不良或预后显着相关的癌症类型。
结果显示，这五种Pan-CAF 亚型丰度增加的肿瘤显示出与免疫细胞激活、ECM 和胶原蛋白相关的活性基因集（节点）的显着富集，表明 CAF 可能具有共同的功能。与具有高比例 pan-iCAF、pan-iCAF-2 或 pan-pCAF 的肿瘤相比，具有高比例 pan-myCAF 的肿瘤表现出最多数量的与平滑肌细胞收缩相关的基因集（图5A）。与 pan-myCAF、pan-dCAF 和 pan-pCAF 比例高的肿瘤相比，pan-iCAF 比例高的肿瘤显示出与白细胞介素信号相关的基因组数量增加，表明Pan-iCAF 可能与更具炎症性的分子微环境有关（图5C, D）。pan-dCAFs和pan-pCAFs比例增加的癌症显示出与细胞周期相关的正富集基因集，表明pan-dCAF和pan-pCAFs比例高的肿瘤与细胞周期增强的分子微环境相关（图5B, E）。
综上所述，这些数据表明，不同的pan-CAF 亚型存在TME 中，它们可能提供有利或不利的环境，通过激活或抑制特定基因通路来促进或阻碍各种癌症类型的肿瘤发展。
5. Pan-CAF亚型与抗 PD1 和抗 PD-L1 治疗耐药的关联
靶向PD-L1 或PD-1的治疗性抗体可以在诊断为转移性尿路上皮癌和转移性黑色素瘤的患者中引起强烈而持久的反应。由于作者观察到特定的 pan-CAF 亚型表达免疫抑制炎症因子（例如，CXCL12、CXCL14），因此进一步利用抗PD-L1治疗的转移性尿路上皮肿瘤和用抗PD-1处理的转移性黑素瘤的公共数据集研究了 pan-CAF 亚型是否与免疫靶向治疗的有效性相关。
结果发现，在接受抗 PD-L1 治疗后出现 PD 的转移性膀胱癌患者中，与 pan-myCAF、pan-dCAF、pan-iCAF 和 pan-pCAF 相关的基因集呈阳性且显着富集（图6A）。接受抗 PD-1 治疗时经历 PD 的转移性黑色素瘤患者中，与 pan-myCAF、pan-dCAF、pan-iCAF、pan-pCAF 和 pan-iCAF-2 相关的基因集呈阳性且显着富集（图6B）。在被诊断为转移性肾癌且在接受抗 PD-L1 治疗时发生 PD 的患者中观察到与 pan-dCAF 相关的基因集的阳性和显着富集（图6C）。
总的来说，这些结果表明，特定的pan-CAF 可能与转移性膀胱癌、黑色素瘤和肾癌中的 ICB 耐药相关。
文章小结
结语
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参考文献
Galbo PM Jr, Zang X, Zheng D. Molecular Features of Cancer-associated Fibroblast Subtypes and their Implication on Cancer Pathogenesis, Prognosis, and Immunotherapy Resistance. Clin Cancer Res. 2021;27(9):2636-2647. doi:10.1158/1078-0432.CCR-20-4226