今天和大家分享的这篇文章是22色研究抗原特异性CD4+T细胞的方案，样本是人类和非人类灵长类动物的PBMC，目的是监测感染性疾病的免疫反应以及开发COVID-19疫苗的安全性。
背景
CD4+ T细胞，也被称为辅助性T细胞(Th)，在适应性免疫反应中发挥着重要作用。主要通过促进B细胞生产对抗病原体的中和抗体或者激活其他细胞免疫细胞，如CD8+ T细胞、NK细胞、巨噬细胞。
为了了解传染病的发病机制和开发合适的疫苗，分析每个T细胞的功能亚群是很重要的。全世界的研究人员都在积极参与关于T细胞对SARS-CoV-2的反应的研究和阐明COVID-19的发病机制。此外，还有许多关于COVID-19疫苗接种的研究，比如Th1和Th2反应之间的平衡。因为非人类灵长类动物模型(NHPs)经常用于与传染病有关的研究还有疫苗研发，设计一套不仅适用于人类，也适用于非人灵长类动物模型的流式方案是很重要的。在这里，作者介绍了一种可以在非人灵长类动物模型的非临床研究以及涉及人类的临床研究中使用的流式多色方案。
样本
Panel方案
这个panel 通过测量趋化因子受体的表达(CXCR3, CCR4, CCR6, 和CXCR5)，将CD4+ T细胞分为Th1、Th2、Th17和外周Tfh (pTfh)。此外，它还包括检测激活的抗体标记(CD154)，脱颗粒标记(CD107a)，细胞因子(IFNγ，TNF, IL-2, IL-4, IL-13, IL-17和IL-21)，趋化因子(MIP-1β/CCL4)，以及免疫检查点/激活分子(PD-1和ICOS)。
配色方案
流式细胞仪：BD FACSymphon
流式结果图
圈门策略
（1）如图(A和E)，利用FSC-A, FSC-H, SSC-A，死活染料从活细胞中分析CD3+T细胞，从CD3+T细胞中分CD4+T和CD8+T细胞。进一步，对于人，用CD27/CD45RO圈门来分析初始或记忆型T细胞；对于猕猴，用CD28/CD95圈门来分析初始或记忆型T细胞。CD154用于检测活化的抗原特异性CD4+ T细胞。
（2）如图(B和F)，主要分析CD4+ T细胞亚群。根据趋化因子受体和细胞因子的表达，CD4+T细胞分为Th1、Th2、Th17、Treg和pTfh。根据 IFNγ (Th1)，IL-4, IL-13(Th2)、IL-17 (Th17)和IL-21 (pTfh)，以及趋化因子受体等即CXCR3 (Th1)、CCR4 (Th2)、CCR6 (Th17)和CXCR5 (pTfh)的表达，测试每种T细胞的反应情况。在CD4+记忆T细胞的分群里，通过绘制CD154和各种细胞因子、趋化因子受体和免疫检查点分子的二维图来分析每种活化T细胞的亚群。
（3）如图(C和G)，在CD4+ 记忆T细胞中圈出CD154+后，继续分析各种细胞因子和IFN-γ的双参数图。
（4）如图(D和H)，在抗原特异性CD8+ T细胞分析基于CD107a表达的MIP-1β， TNF和IFN-γ。
参考文献：
Nogimori T, Moriishi E, Ikeda M, Takahama S, Yamamoto T. OMIP 075: A 22-color panel for the measurement of antigen-specific T-cell responses in human and nonhuman primates. Cytometry. 2021;1–4.
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