研究生复试中少不了考察科研素质及专业能力，这就对考生了解学科热点、熟悉学术前沿提出了较高的要求。想要在考研复试中脱颖而出，拔得头筹，那就得具备一定的文献阅读能力，从而了解更多专业词汇的英文，掌握科研技巧，提高科研素质。
本期“小卫带读”介绍甲基化与食管鳞状细胞癌的进展和预后相关内容，篇幅较长。对于初次接触该类文章的同学建议直接从材料与方法入手，可以快速梳理整个实验的设计。虽然本文难度稍大，但是甲基化是近年来的研究热点，同学们可以提前熟悉，小卫为大家摘取并整理了材料与方法的部分，大大降低了阅读难度。
通过本次文献带读活动，希望大家在面对完全陌生或者不熟悉的领域的文章时，能不慌乱，从实验设计，即实验步骤入手，对实验进行拆分，从而降低阅读难度。
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文献内容截取
Part 1
患者和标本
135名接受手术的ESC患者。
取初级ESCC组织和相邻的正常组织。标本被分为两平行组：一组冷冻并在-80℃提取DNA和RNA；另一组福尔马林固定并嵌入石蜡中。
Part 2
细胞系和治疗
细胞系及培养：
◉ 人类食管癌细胞系（Kyse170、Eca109、TE1 和 TE13）在RPMI-1640 介质(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，于37℃和5% CO2条件下辅以10%热灭活化胎儿牛血清(FBS) (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)培养。
◉ 人类正常的食管上皮细胞系 HEEpiC 按照制造商的说明培养。
治疗：
需要时，细胞（2 个× 105/mL） 用 5 μM DNA 甲基转移酶抑制剂5-aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC)(Sigma, St Louis, MO, USA)治疗72 小时，每 24 小时补充5-Aza-dC；或0.3μM组蛋白去乙酰酶抑制剂TSA (Sigma, St Louis, MO, USA)24小时；或5 μM 5-Aza-dC 组合 48 小时，后与 0.3 μM TSA 组合为额外 24 小时。控制细胞未接受药物治疗。
Part 3
RT-PCR（qRT-PCR）测定
◉ 总RNA使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取的。
◉ 第一链cDNAs按照制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒，从总RNA的2μg合成 (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)。
◉ 定量实时PCR测量采用Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technology, Foster City, CA, USA)。
◉ 相对基因表达是由 2–ΔΔCT规范化到 GAPDH所确定的。
◉ 所有样本都是三次运行。
Part 4
双硫基基因组测序（BGS）
和转化特异性和甲基化特异性聚合酶链反应（BS-MSP）测定
◉ 基因组DNA通过简化的蛋白酶K消化法提取。
◉ 使用Epiect快速双硫化转化试剂盒 (Qiagen, Germany)对基因组DNA进行双硫化修饰。
◉ BGS测定后首先确定了CpG岛屿内甲基化CpG位点的分配情况。使用一组 BGS引物，然后克隆成pGEM-T载体 (Promega, Madison, WI, USA)，通过自动荧光测序随机挑选和排序的8到10个克隆。根据BGS测定的甲基化CpG位点分布情况，三个区域的甲基化状态由 BS-MSP 方法使用甲基化或未甲基化特异性底注组确定。
BS-MSP产品在2%的阿加罗斯凝胶上与溴化乙基染色分析。
Part 5
荧光素酶报告构建
和双荧光素酶报告分析
◉ 为了探讨转录因子和CpG位点甲基化状态对ZNF667-AS1或ZNF667转录活性的影响，构建了ZNF667-AS1和ZNF667的启动器质粒。
◉ 放大的碎片嵌入到 pGL3 基本载体(Promega, Madison, WI, USA)，重组质粒被测序和确认。
◉ pGL3-A1、pGL3-Z1 和 pGL3-Z2 结构分别以体外甲基化。
◉ Eca109 细胞 （1 × 105/每井）接种24井培养皿24小时前转染。
◉ 200纳米化或甲基化ZNF667-AS1或ZNF667构造，pGL3-对照载体（正对照），或pGL3基本载体（负对照）然后与10ng的pRL-TK载体 (Promega,Madison, WI, USA)使用脂质甲胺20000 (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)与10纳克的pRL-TK载体共同感染。
◉ 48小时后，荧光素酶活性由双荧光素酶报告机测定系统(Promega, Madison, WI, USA)确定。通过萤火虫荧光素酶与Renilla荧光素酶活性的比值来表达荧光素酶活性。
Part 6
染色质免疫沉淀（ChIP）测定
◉ ChIP 检测使用EZ-Magna ChIP A/G(17-10086, Upstate, Millipore, MA, USA)套件进行。套件根据制造商的说明进行。
◉ 采用抗SP1、E2F1、TET1、H3K27me3、UTX或JMJD3抗体(每CHIP 4μg，Upstate、Millipore、MA、USA)进行免疫沉淀。
◉ 用实时qPCR分析（补充表2中的引物）对CHIP衍生DNA进行定量分析)。
◉ 试验一式三份。
Part 7
细胞转染
◉ 对于ZNF667-AS1或ZNF667的过表达，编码ZNF667-AS1或ZNF667的cDNA被PCR扩增并亚克隆到PCDNA3.1载体中(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，分别命名为pcDNA3.1-ZNF667-AS1或pcDNA3.1-ZNF67。
◉ Eca109 和TE13 细胞分别与 pcDNA3.1-ZNF667-AS1 或 pcDNA3.1-ZNF667 表达质粒或空载体 （pcDNA3.1-NC） 进行转染，最后浓度为 2 μg/μL，使用 FuGENE HD 转染试剂 (Promega, Madison, WI, USA)。
◉ 转染后，使用800μg/mL的G418 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)分离抗性细胞。
◉ 对于ZNF667-AS1或ZNF667的抑制，Kyse170细胞分别使用FuGENEHD转染试剂与ZNF667-AS1或ZNF667特异性shRNA质粒进行转染，并用加扰shRNA作为阴性对照。
◉ 对于E2F1、TET1、UTX和JMJD3的过表达，编码它们的cDNA被PCR扩增并亚克隆到PC DNA3.1载体中(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。
Part 8
细胞活力测定
用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定转染Eca109和TE13细胞或shRNA转染Kyse170细胞的PCDNA3.1-ZNF667-AS1或PCDNA3.1-ZNF667的活力。
将10微升的CCK-8 (Dojindo, Japan)加入到培养细胞的100μl中，在37℃含5%CO2的加湿培养箱中孵育2h后，在450nm波长处测量每口井的吸光度值。
Part 9
软琼脂菌落形成试验
在克隆形成试验中，转染细胞在37℃和5%CO2下定期培养1周。
存活的菌落在4%多聚甲醛溶液中用结晶紫染色，显微镜下计数可见菌落(≥50个细胞)。
Part 10
伤口愈合试验
对于伤口愈合试验，在培养的细胞中，用一个200μL的移液管尖直接划伤伤口，然后在显微镜下创建伤口后，在每口井0、12和24小时的相同位置捕捉图像。测量细胞迁移到划痕区的相对距离，计算细胞愈合百分比。
Part 11
细胞侵袭试验
细胞侵袭试验采用24井跨井室(Corning, Kennebunk, ME, USA)，按照制造商的指示进行。
Part 12
亚细胞分馏
为测定ZNF667-AS1的细胞定位，用核/胞浆分馏试剂盒(BioVision，Milpitas，CA，USA)按照制造商的指导方针收集Kyse170和TE1细胞（1×106）的胞质和核分数。
以GAPDH基因作为细胞质定位控制，U6基因作为细胞核定位控制。
Part 13
蛋白印迹分析
在冰冷的RIPA裂解缓冲液中制备总细胞裂解物，然后超声处理。用BCA蛋白法测定蛋白质含量，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离20μg蛋白质裂解物，转移到硝化纤维素滤膜上。
首先用ZNF667特异性初级抗体(1：1000稀释，兔抗人多克隆抗体，GeneTex, Alton Pkwy Irvine, CA, USA)或E-cadherin(1：1000稀释，小鼠抗人单克隆抗体，Abcam，英国)孵育，然后用辣根过氧化物酶结合二次抗体孵育。
以GAPDH(1：500稀释，小鼠抗人单克隆抗体，ABCAM，英国)作为负载对照。
Part 14
RNA免疫沉淀（RIP）测定
用MagnaRIP™RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)按照制造商的指示进行RIP测定。
抗TET1、UTX或JMJD3的抗体(Upstate，Millipore，MA，USA)用于免疫沉淀。
以IgG抗体作为阴性对照。
纯化后的RNA进行qRT-PCR分析。
Part 15
RNA下拉检测
用RiboMAX™大规模RNA生产系统(Promega，Madison，WI，USA)对LncRNA ZNF667-AS1进行体外转录，用Pierce™磁性RNA蛋白拉下试剂盒(ThermoScience，Rockford，lL，USA)按照制造商的指示进行生物素标记和纯化。
用50pmol纯化生物素化转录本在4℃下孵育2毫克细胞全细胞裂解物1小时；与RNA结合蛋白复合物与链球菌磁珠分离；这些蛋白质通过SDS-PAGE分离，通过蛋白印迹分析检测。
Part 16
hMeDIP-qPCR分析
采用简化的蛋白酶K消化法从细胞中提取基因组DNA。
如前面所述，进行了hMeDIP测定。
即基因组DNA变性，然后用抗-5hmC抗体或IgG对照抗体和蛋白G磁性Dynabeads免疫沉淀(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)。然后用蛋白酶K处理珠子，用qPCR分析下拉DNA。引物列于补充表2。
Part 17
统计分析
◉ 所显示的所有数据都表示从具有均值标准误差的三重独立实验中获得的结果（均值±标准差）。
◉ 实时RT-PCR结果表示为均数±标准差。
◉ 组间差异采用t检验。
◉ 皮尔逊卡方检验分析不同组间基因甲基化的情况。
◉ 采用Kaplan-Meier法和Log-rank或Breslow试验来估计总体生存率。
◉ cox多元测试用于调整潜在的混淆变量，并评估患者预后的独立预测因子。
◉ 采用SPSS19.0软件。
◉ 所有统计检验都是双侧的，P<0.05认为差异有统计学意义。