本周与大家分享的文章是《自然通讯》杂志上发表的“人类食管方形细胞癌微环境中的免疫抑制景观”。本文通过单细胞测序、流式细胞术、免疫组织化学等方法综合分析肿瘤浸润性免疫细胞的特征，结合详细的数据分析，揭示了抑制性免疫状态的概况。 01. ECSS中免疫细胞的单细胞RNA测序为了在人类ESCC中生成免疫细胞的深层转录图谱，作者分析了单细胞基因表达程序，并对从新鲜ESCC分离的7对CD45+细胞浸润的免疫细胞进行了TCR测序，手术切除肿瘤和匹配的ESCC邻近组织（图1a）。在去除低质量细胞后，总共保留80787个细胞（每个样品3248-9097个）用于进一步分析。在这些细胞中，每个细胞平均检测到1170个基因。分析样本的临床信息和苏木精-伊红（he）染色结果如补充图1所示。为了系统地分析免疫细胞群体，对所有样本的单细胞数据进行标准化和总结，并进行无监督聚类以识别可区分的群体。成功鉴定了肿瘤浸润性免疫细胞的主要类型，包括T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞（DC）、B细胞、浆细胞和肥大细胞，以及与分选细胞混合的一小部分其他非免疫细胞，经典标记物的表达与结果一致（图1b-d）。通过比较肿瘤和邻近组织中CD45+细胞中每种细胞类型的百分比，作者发现肿瘤中的T细胞和单核细胞/巨噬细胞增加，B细胞和NK细胞的百分比降低（图1E），不同患者的肿瘤之间的免疫组分存在很大差异（图1F）。T细胞是肿瘤中最丰富的免疫细胞类型，占CD45+细胞总数的30–71%（1g）。七个样本分为两组。三对肿瘤相邻组织样本（s133、s134和S150）在其他4对肿瘤邻近细胞样本（S135、s149、s158、s159）中，6-12%的细胞为T细胞（图1h-i）.作者将ESCC中浸润免疫细胞的主要部位与其他类型的癌症进行了比较。作者发现，ESCC属于侵袭性更强的T细胞和单核细胞/巨噬细胞以及侵袭性更小的B细胞的肿瘤类型（图1J）这与作者的观察结果一致，即与邻近组织相比，ESCC的T细胞和单核细胞/巨噬细胞增加，B细胞比例减少（图1E）。
2T细胞和NK细胞的聚集和亚型分析由于T细胞和NK细胞是TME中的主要细胞毒性免疫细胞，作者对所有样本中的T细胞和NK细胞进行无监督聚类。鉴定出6个CD4 T细胞簇、7个CD8 T细胞簇、1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇，每个细胞簇显示出不同的标记物特征（2a-b）。在CD4 T细胞中，CD4-c6-foxp3具有较强的Treg标记，而CD4-c5-stmn1具有较强的衰竭细胞标记。Cd4-c4-ifit3具有丰富的细胞毒性特征；Cd8-c1-nkg7是一种激活的细胞毒性Cd8 T细胞，而Cd8-c5-ccl5和Cd8-c6-stmn1的衰竭分数低于Cd8-c7-tigit（2c-d）。这一结果表明，大多数肿瘤浸润性CD8 T细胞在ESCC中处于激活、记忆或衰竭状态。在Treg（cd4-c6-foxp3）中激活的一些基因与cd4 T细胞（cd4-c5-stmn1）耗尽细胞的特征基因重叠。将两个细胞簇的基因表达与幼稚样细胞群（cd4-c1-ccr7）的基因表达进行比较。在衰竭细胞和Treg细胞中富集的基因包括调节分子和许多共抑制和共刺激受体（2e）。细胞毒性和耗尽的CD8 T细胞都表达许多效应分子（2f）。Cd8-c7-tigit表达高水平的TOX和NFATc2（2G）。这表明cd8-c5-ccl5处于衰竭早期，cd8-c7-tigit处于衰竭阶段，cd8-c6-stmn1可能是cd8-c5-ccl5和cd8-c7-tigit的过渡阶段。然后，作者分析了样本中CD8 T细胞中CD39的表达。结果表明，与其他集群相比，在衰竭和衰竭早期，CD8 T细胞（C5、C6、C7）中CD39的表达显著高于其他集群。此外，除s158外，大多数肿瘤CD8 T细胞中CD39的表达高于邻近组织（2H）。
3肿瘤中T细胞和NK细胞状态的变化作者比较了肿瘤和邻近组织中的T细胞。与邻近组织相比，肿瘤中Treg细胞簇CD4-c6-foxp3和CD45+细胞中耗尽的CD4 T细胞CD4-c5-stmn1的百分比显著增加。Treg和耗尽的cd4t细胞占肿瘤中cd4t细胞总数的50%以上，但在邻近组织中仅占25%（3a-b）。肿瘤中Treg细胞比例增加（3C）。同样，耗尽的CD8 T在ESCC细胞中富集，而PD1在ECSS（3c-f）中的表达增加。相反，活化的细胞毒性CD8 T细胞组（CD8-c1-nkg7）显著减少，从邻近组织的23%降至肿瘤组织的4%（图3e）。肿瘤组织中的Treg和耗尽的CD4和CD8 T细胞显著增加，表明肿瘤中存在免疫抑制环境。作者还观察到，与邻近组织相比，肿瘤组织中的NK细胞显著减少（1E）。此外，NK细胞的主要细胞簇是邻近组织中的NK-c1-ncr3，肿瘤中的NK-c3-klrc1，肿瘤中的NK-c2-stmn1也急剧增加（3G）。Nk-c1-ncr3高表达ncr3、cd266、nkg7和lamp1，Nk-c3-klrc1和Nk-c2-stmn1高表达klrc1和itga1抑制性受体（3H）。流式细胞术显示nkg2a（klrc1）在ESCC NK细胞（3I）中的表达增加，NK-c3-klrc1和NK-c2-stmn1的细胞毒性评分非常低，耗尽细胞的比例增加（3j），表明NK细胞在ESCC中不足且受损。作者进一步分析了T和NK细胞簇中的细胞周期，以确定细胞的增殖能力。作者发现富含耗竭基因的cd4-c5-stmn1、cd8-c6-stmn1和nk-c2-stmn1具有高度增殖性（图3k-m），表明耗竭的T细胞是肿瘤中主要的增殖免疫细胞腔。
04 、CD4和CD8 T细胞的克隆性 为了确定T细胞的克隆选择和扩增是否导致了所观察到的表型多样性，作者进一步分析了来自相同样本的偶联TCR测序结果。作者观察到总共15654个独特的TCR序列，克隆扩增，克隆大小从2到2600不等。TCR克隆型组成在患者之间变化很大。虽然一些患者显示出最小的克隆扩增（S134，S135和S158），但其他患者则以少量的T细胞克隆（S149和S150）为主导。在S149和S150肿瘤中，65%和68%的T细胞具有两个以上的TCRs，这表明T细胞在这些肿瘤中具有高克隆性扩增（4B），与相邻组织相比，7例患者中有4例肿瘤的扩增克隆增加(图4B)。每个簇实际上是由不同的克隆型组合子集组成的（4C）。CD8 T细胞的克隆细胞明显多于CD4 T细胞，naïve CD4-C1-CCR7细胞的克隆扩展非常有限(图4d)。与相邻组织相比，肿瘤中的treg具有更多的克隆数量(图4f)，这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中treg比例更高的原因。作者发现CD4细胞中包括Tregs在内的所有簇间的TCR序列共享，而CD8细胞中除C2外的所有簇间的TCR序列共享(图4G-H)。CD8-C7-TIGIT和CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1之间共享的克隆数分别为166个(9.0%)和156个(8.4%)(图4I)。Treg型CD4-C6-FOXP3在肿瘤中具有相同的趋势，在CD4-C1-CCR7中显示14.4％的共享克隆型，在相邻组织中显示40.7％(图4j和补充图8c)。细胞毒性细胞、力竭细胞和Treg细胞中的克隆T细胞在肿瘤和邻近组织之间的TCR有限(补充图8d)，这表明一些Treg细胞和naïve CD4 T细胞可能具有共同的起源。作者的数据与最近的一项研究一致，该研究报道不同簇的T细胞并非完全独立，但可能会经历广泛的状态转变。
总结：作者根据单细胞测序的结果发现在癌症细胞中CD4+、CD8+T细胞，NK细胞与临近组织相比有较明显的变化，且在肿瘤环境中存在免疫抑制。 PS. 由于篇幅有限这次的分享分成了上下两部分，预知后事如何，且看下期分解哦~ PSS. 留言可以获得相关文献信息~ 本文涉及技术： 流式细胞术
本文涉及技术： 免疫组化
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