《全细胞超高分辨率三维成像》
黄等人，2016年，第166、1028–1040单元
全细胞超高分辨率三维成像
摘要
荧光纳米显微镜，或称超分辨率显微镜，已经成为细胞生物学研究的重要工具。然而，由于其在深度方向(50-80 nm)的分辨率通常较低，并且在厚样品中的分辨率迅速下降，其实际生物应用实际上被限制在二维和薄样品上。在这里，我们介绍了全细胞4Pi单分子开关纳米显微镜(W-4PiSMSN)的研发，这是一种光学纳米显微镜，可以在整个哺乳动物细胞中以10到20nm的分辨率成像三维(3D)结构。我们通过在较大的3D细胞体积中成像从噬菌体到核孔、纤毛和突触复合体的复杂分子结构，展示了W-4PiSMSN在不同研究领域的广泛适用性。
介绍
细胞生物学的重大进展与显微镜的创新紧密相连。例如，荧光显微镜的发展使特定标记的感兴趣蛋白质能够在亚细胞内定位。然而，光的波动特性将传统光学显微镜的分辨率限制在~200纳米，使得亚细胞结构和蛋白质组装的细节无法分辨。超分辨率荧光显微镜或纳米显微镜技术的出现，如受激发射耗尽(STED)和单分子开关纳米显微镜，已经将荧光显微镜的应用范围扩展到衍射极限之外，在分辨率上实现了高达10倍的提高。这些方法现在正在成熟，并提供了观察未见过的生物现象的机会。纳米技术有一个共同的原理：它们通过独立地打开和关闭发射来在空间上分离不可分辨的荧光分子。具体地说，诸如光激活定位显微镜(Palm)、荧光光激活定位显微镜(FPALM)和随机光学重建显微镜(STORM)的SMSN方法使用随机方法，其中在任何特定时刻只有一小部分荧光分子被打开，而大多数分子保持在非荧光的“暗”或“关”状态。超分辨率图像是从数千到数百万个单分子的位置重建的，这些单分子已经被记录在数千个相机画面中。
这种成像策略最初应用于二维(2D)的单目标显微镜，后来扩展到三维(3D)。虽然这些仪器在焦面(横向，x-y)上的分辨率为20-40 nm，但在深度方向(轴，z)上的分辨率通常仅限于50-80nm。然而，通过使用双目标“4Pi”检测几何结构，可以进一步提高分辨率。
使用两个目标可以使探测效率翻倍，从而在全部三个维度上都将定位精度提高1.4倍。此外，在4Pi几何结构中采用两个物镜允许在探测器处创建单分子发射干涉图案，从而使轴向定位精度比单一目标方法提高7倍，就像使用干涉PALM(IPALM)和4PI单标记开关纳米显微镜(4Pi-SMSN)所展示的。例如，这种改进的分辨率使得能够以10纳米的轴向分辨率生成病灶粘连的解剖图。然而，这种方法最初仅限于厚度为~250
nm的样品，最近仅限于700-1000 nm的样品。由于哺乳动物细胞的典型厚度为5-10微米，这限制了光学显微镜在10纳米各向同性分辨率尺度上对细胞的薄子体积，从而抑制了在整个细胞中对延伸到几个微米以上的细胞器成像的能力。
在这里，我们提出了一种新的iPALM/4PI-SMSN的实现，称为全细胞4PI单分子开关纳米显微镜(W-4PiSMSN)，它在不影响分辨率的情况下将该技术的成像能力扩展到整个细胞。W-4PiSMSN能够以10-20 nm的各向同性分辨率体积重建10毫米厚的样品，与以前的iPALM/4PI-SMSN实现相比，样品厚度提高了10-40倍。我们的方法允许对几乎任何亚细胞结构进行超高分辨率3D成像。为了证明这一点，我们对内质网(ER)、噬菌体、线粒体、核孔复合体、初级纤毛、高尔基体相关的COPI囊泡和小鼠精母细胞突触复合体进行了成像。通过这些例子，我们展示W-4PiSMSN打开了解决以前无法回答的细胞生物学问题的大门。
结论
W-4PiSMSN的研制
为了实现一个在整个哺乳动物细胞厚度上达到10到20纳米3D分辨率的系统，我们扩展了以前的iPALM和4Pi-SMSN的开发。在这些系统中，荧光发射由两个相对的物镜收集并组合在一起进行干涉。根据分子的轴向位置，光将产生建设性或破坏性的干涉，如探测器上分子图像的亮度所示。然而，位于轴向位置的分子相差一半波长的倍数会导致相同的干涉图样，并导致在确定其轴向位置时的模糊性。这种定位模糊会导致加扰图像包含轴向移动的图像伪影(称为重影图像)，其样本厚度超过约250 nm。这不仅可以通过调节单分子图像的亮度，而且还可以使用与z位置相关的形状来确定分子的轴向位置，从而避免这种情况。为了解决这一问题，提出了一种基于高阶矩的双曲镜修正系统点扩展函数偏心分析方法，将像体厚度扩展到700~1000 nm。然而，这些方法存在着明显的缺陷，如定位密度较低，这是因为这些方法的计算过程高度选择性地聚焦于PSF的细微特征。这种方法也容易受到样品诱导的光学像差的影响，当对样品中更深的生物结构成像时，这种光学像差会改变PSF的形状。因此，其应用仅限于靠近盖玻片的薄结构。
为了使4Pi-SMSN能够更深入地探测细胞，并将这项技术的应用扩展到更大的细胞特征，我们开发了W-4PiSMSN。首先，扩展了阿基诺等人的光学设计，我们在4Pi干涉腔的两臂上加入了可变形反射镜。我们使用这些反射镜来校正仪器光束路径中的缺陷，并针对不同厚度的样品优化PSF质量。可变形反射镜还可以补偿样品引起的像差模式，如球差，这些模式随样本和深度的不同而不同。此外，我们可以使用这些反射镜在两个干扰臂中引入散光，而不会进一步增加系统的复杂性。因此，可变形反射镜能够以与深度和样本无关的方式实现无损害、可重现的PSF。
其次，在Brown等人早期方法的基础上，我们开发了一种分析方法，它结合了来自(1)4Pi-PSF的干涉相位的信息，该干涉相位允许精确的轴向定位，但不区分不同的干扰峰，以及(2)散光4PiPSF的偏心率，其将轴向局部化缩小到单个干扰峰，但本身并不提供4Pi干涉的精度。我们的新分析算法将在每个时间和z深度窗口中成像的大量分子解释为W-4PiSMSN系统并发状态的集合测量，并确定了散光PSF的偏心率与4PI-PSF的干涉相位之间的关系。然后，所有相应分子的轴向位置可以高精度且清楚地使用单调度量来指定，该单调度量设计用于描述PSF的整体形状，并在适度像差存在的情况下保持其单调性。由于这种分析是针对定义明确的时间和轴向数据子集进行的，因此我们对其进行了推广，以识别和校正成像过程中的漂移(来自系统和样本)。我们的方法对像差是稳健的，提高了轴向位置分配的可靠性和效率，因为它自动适应4Pi-PSF的形状和干扰模式的变化。
W-4PiSMSN超高分辨率成像
为了演示我们新系统的分辨率，我们首先对ER进行了成像。用抗GFP抗体对COS-7细胞中过表达的跨膜蛋白mEmerald-Sec61进行内质网染色。我们将内质网想象为直径为60-100 nm的中空管组成的连通网络。水平和垂直截面都显示了以前只能用电子断层扫描才能解决的3D膜轮廓。这种高3D分辨率由22 nm的傅立叶壳相关值定量支持。为了在更小的结构上测试我们的方法，我们在COS-7细胞中成像了抗体标记的微管，这是SMSN的黄金标准。W-4PiSMSN在没有任何可检测到的成像伪影的情况下，解决了这个25
nm的微管细丝，它在所有方向上看起来都像一个包裹着抗体的中空核心。此外，数据集具有每10*10nm2表面积约5.5个局部化事件的高局部化密度。通过定位事件与小管轴线的径向距离显示定位事件显示出具有16-24
nm的半高全宽(FWHM)的高斯峰。考虑到一级和二级抗体的使用增加了成像染料分子的实际位置的不确定性，我们得出结论，我们的仪器的3D分辨率远低于20 nm(FWHM)。
为了证明我们在另一个具有挑战性的目标上的方法，我们对T7噬菌体进行了成像。它们的特征是直径约60纳米的二十面体形状的衣壳，这是以前只有通过冷冻电子显微镜(Cryo-EM)技术才能看到的衣壳。我们使用Alexa Fluor 647 NHS Ester(与伯胺反应)在纯化的T7噬菌体表面非特异性标记蛋白质，并将噬菌体固定在盖玻片上。单噬菌体在x-y、y-z和x-z方向的图像切片在所有方向上都显示一个空心中心。为了进一步细化检测到的噬菌体结构的细节，我们采用了最初为冷冻EM开发的断层图像平均方法。通过组合115张T7图像，我们的平均重建揭示了T7噬菌体的二十面体形状。垂直于长轴的切片显示预期的五角形，而平行于长轴的切片显示六边形。然而，我们的方法还没有清楚地解决T7噬菌体的~23 nm尾巴和纤维结构。这可能是由于表面蛋白的标记不完整或这些结构的灵活性造成的。尽管如此，我们的W-4PiSMSN系统已经能够使用光学显微镜可视化噬菌体的超微结构。
我们通过对Alexa Fluor 647和Cy3B免疫标记的COS-7细胞的微管和线粒体成像来测试W-4PiSMSN的双色成像能力。我们的重建显示微管在距线粒体顶面和底面约10-20 nm的距离内运行。我们的系统将轴向局部化与psf形状解耦，后者容易受到样品诱导的光学像差引起的深度相关失真的影响。当单目标系统依赖于PSF形状时，W-4PiSMSN方法使用相对干涉幅度来确定单个分子的轴向位置。然而，多色成像是具有挑战性的，因为空间干涉调制频率是波长相关的，并且在不同的颜色通道之间是不同的。为了解决这个问题，我们使用基于瞳孔函数的方法推导出调制频率。我们的模拟结果通过配准来自仿射变换矩阵的两个颜色通道进行了实验验证，该通道是使用固定细胞中的双色标记的线粒体进行校准的。
W-4PiSMSN全细胞三维成像
成像体积大于~1.2um需要轴向样品扫描，因为焦外大于~600 nm的分子不能被有效地识别和定位。因此，光学部分必须记录在不同的轴向样品位置，然后合并以获得完整的细胞体积。与传统的三维纳米显微镜相比，W-4PiSMSN优越的定位精度对每个体积截面的定位精度(即避免体积畸变)和拼接过程提出了更高的要求。在切片合并过程中，由于样品引起的像差或漂移引起的相邻光学切片之间的微小不对准会导致分辨率的显著下降和超分辨体积的畸变。
我们设计了我们的系统来最小化漂移：我们的仪器设计利用了一个水平对称平面，该平面与物镜的公共焦面和干涉腔的分束器立方体重合。这种对称的设计使显微镜的干涉腔对温度变化不敏感，从而导致干涉腔的两臂热膨胀大致相等。为了补偿机械和热波动引起的任何剩余仪器和样品漂移，我们开发了一套硬件和软件工具。通过将近红外激光束通过一个物镜聚焦，并用另一个物镜检测聚焦，从而使物镜相对于彼此以3D方式稳定。这允许检测3D中的相对目标运动，然后可以通过反馈环路对其进行补偿。此外，在扩展的相关体中，我们使用基于冗余的漂移校正方法对1到2分钟窗口的三维体数据段进行互相关。在这些短数据段中的每一个部分，建立散光和干涉相位之间的独立关系。对于不同的分段，这些关系之间的任何差异都被视为漂移。上述方法使我们能够完全补偿样品和仪器的漂移以及由于测量的轴向扫描特性而导致的干涉式4Pi腔的两个臂之间的光路变化。
为了证明W-4PiSMSN系统的全细胞成像功能，我们使用了针对外膜蛋白TOM20的抗体在COS-7细胞整个厚度上对线粒体进行了成像。图3揭示了在4.3um深度处的外膜轮廓和明显互连的线粒体网络。我们无法在该体积内检测到任何有意义的重影图像。
为了进一步证明在整个细胞的整个厚度范围内都保持图像质量，我们在核被膜上成像了核孔复合物（NPC）。通过用识别NPC胞质细丝（Nup358）成分的抗体进行免疫标记，我们可以在细胞核的顶部，侧面和底部重建NPC。与线粒体一样，我们的方法揭示了几乎整个核表面的轮廓，其中明显的内陷和细微的起伏（通常仅通过电子显微镜[EM]可视）。
揭示高尔基体相关的COPI囊泡
接下来，我们对COPI囊泡进行成像，传统上只有EM才能解决这些囊泡，因为它们的直径约为100nm，并且在高尔基池中密集堆积。此外，由于高尔基体的位置靠近细胞的中间，因此在中央z平面上记录高质量数据是对仪器3D分辨率功能的挑战性测试。图5显示了COP，它是外部COPI复合物中的一种蛋白质，使用Alexa Fluor
647在BSC-1细胞中进行了免疫染色。令人惊讶的是，我们看到了细胞内独特的空心COPI涂层球体。我们的3D图像可分辨直径约100 nm的单个COPI囊泡，与之前的测量结果一致。此外，厚度为300nm的截面显示，在没有COPI标记的情况下，被COPI涂层的结构围绕500至1,000nm（x和y）乘以500nm（z）的区域堆积，大概包含高尔基体。
揭示睫状膜GPCR的组织
初级纤毛是一种从细胞表面突出并起细胞天线作用的基于单微管的细胞器，它的大多数高分辨率研究都依赖于EM。透射电镜图像通常仅显示纤毛的小部分，因为样品是整个结构的约70至100nm厚的随机倾斜截面，最长可达10 um，宽约为250 nm。扫描EM图像可以轻松显示高分辨率的整个纤毛。但是，这些图像完全缺少有关特定蛋白质定位的信息。以前对纤毛的纳米显微镜研究依赖于从2D数据集推断3D组织。在这里，我们使用W-4PiSMAN对高3D分辨率的hTERT-RPE1细胞中整个初级纤毛上的G蛋白偶联受体SMoothed（SMO）进行成像。SMO用pH敏感的GFP（pH-SMO）标记，该序列用作用Alexa Fluor 647标记抗体的表位。我们观察到，过表达的pH-SMO定位于纤毛膜上，该膜形成了3–10 um长的空心圆柱体（图6），直径从〜160至280 nm不等。我们的睫毛膜W-4PiSMSN图像使我们能够精确测量纤毛沿其整个长度的直径。有趣的是，我们发现纤毛直径并不总是恒定的。相反，一个示例的纤毛在其长度的中途显示出约50
nm的突然收缩。我们推测直径的这种变化可能与9 + 0微管轴突的变薄相对应，后者已知是从三重态微管转变为双重态，最后是单重态。睫状体尖端不狭窄，但具有球根形状，与EM中观察到的结构一致。睫状膜的高分辨率重建还使我们能够将膜管“展开”为平坦表面，从而实现数据量化，例如在复杂的几何形状中进行聚类分析和共定位测量。接下来，我们检查了沿睫状膜的分子的局部密度，以确定具有较高浓度的pH-SMO的区域。在基部周围，小的球根突起和沿纤毛长度的条纹上存在较高的局部密度。这些突起可能是从纤毛出芽的囊泡（直径约150-200 nm），因为据报道胞体从某些纤毛出芽。
解决全小鼠精母细胞的突触复合体
为了最终证明我们的仪器能够对厚达10um的细胞进行成像，我们在减数分裂前期的粗线期将小鼠精母细胞核的突触复合物染色。虽然使用结构照明和4Pi显微镜以100-200 nm的分辨率对突触复合物成像，但更高分辨率的光学图像仅限于<1um厚度的染色体扩展。在这里，我们检查了从W-4PiSMSN的17至18日龄小鼠的睾丸中收获的精母细胞，并成像了常染色体突触复合物的成对侧向元素的扭曲带，通过免疫标记突触复合蛋白3（SYCP3）突出显示横向元素的组成。由总共126个光学部分（在6个重复周期中成像的21个深度位置）重构，整个3D图像跨过近9um的深度，并且解析了单个常染色体突触复合体的SYCP3子结构，具有前所未有的清晰度，而与它们的方向或深度无关。此外，可以使用基于欧几里德度量的聚类算法在单个单分子定位上分离出代表成对的常染色体同源物对的19个突触复合物。因此，我们的方法保证了在核的建筑元素的背景下可视化染色体支架的纳米级空间组织的能力，其中许多元素在常用的铺展染色质制剂中会丢失。
讨论
通过数项技术创新的融合，我们证明了W-4PiSMSN为细胞超微结构提供了前所未有的途径，其整个体积具有约10至20nm的各向同性分辨率。该分辨率是传统显微镜的20至50倍，其成像深度比最新的iPALM和4Pi-SMSN提高了约10倍。这种发展极大地扩展了基于4Pi的SMSN的应用范围：成像不再局限于小部分细胞内的特征。取而代之的是，我们能够对跨越大体积的细胞器进行成像，例如线粒体网络，核包膜和突触复合物，我们可以将其完整捕获。因此，W-4PiSMSN是一种多功能且功能强大的工具，它有望为蛋白质如何在整个细胞内的整个细胞器中分布提供新的视角，这是细胞生物学中一项关键的未解决挑战。
是否有进一步提高SMS纳米显微镜空间分辨率的空间？首先，SMS分辨率取决于可以定位闪烁分子的精度。精度大约与PSF的清晰度成正比，并且对于可忽略的背景噪声而言，其精度与检测到的光子数的平方根成反比。我们的方法主要集中于创建最清晰的PSF并检测尽可能多的发出的荧光。最近，出现了有希望的发展，它增加了每个分子发射光子的数量，我们在这里没有开发。不幸的是，到目前为止，这些进步是以增加记录时间为代价的。但是，我们预计，使用新一代的荧光团或精细的成像缓冲液，这些方法可以进一步提高图像质量。
第二，SMSN图像的图像质量或空间分辨率取决于局部分子的密度。我们展示的应用实例表明，小的特征，例如圆柱形免疫标记微管（直径约40 nm）或ER管（直径约60 nm）现在可以使用光学显微镜在3D模式下轻松解决。观察者通过从预期的管状结构中进行心理推断，填补了沿小管的分子分布中的空白这一事实，对图像的解释有所帮助。我们利用了多种计算图像处理技术，包括对噬菌体数据进行粒子平均，对联突复合物进行聚类以及对纤毛进行“展开”，以重建复杂结构。这些方法给数据解释增加了约束（例如纤毛是管状的）并且可以针对当前的细胞生物学问题进行定制，这些方法使我们能够提取结构细节，这些细节比标记密度暗示的要微妙得多。最终，标记密度受探针靶标（通常是蛋白质）的密度限制。允许膜靶向的新标记方法的发展克服了这一限制，并且还提供了揭示单个细胞器膜边界的可能性。利用随机瞬态化学结合的互补方法可以进一步解决有限的荧光标记物库，并且理论上允许无限数量的局部分子。但是，即使使用常规标记技术，W-4PiSMSN仍能够在众多设置中可视化否则无法访问的结构，如所呈现的大量应用所证明的那样。
总而言之，我们相信W-4PiSMSN的发展代表了十多年来高分辨率荧光成像技术研究的高潮，并建立了具有10nm范围内分子特异性和分辨率的3D生物成像作为常规成像技术。
全细胞4Pi单分子开关纳米显微镜
整个细胞的成像；超高分辨率；三维成像
在前人的基础上扩展了光学设计，开发了分析方法。在整个细胞达到10到20纳米3D分辨率。（有点夸大。。）。但的确有很多新的应用，举例翔实，噬菌体 核孔 纤毛 突触复合体都有新的发现。