气道小丘是肺部组织中的神秘结构。之所以命名为小丘（hillocks），是因为基底干细胞不断生成细胞，在组织表面形成了一个个山丘样的结构。与典型的基底干细胞不同，这些干细胞表达鳞状细胞标志物基因Krt13。然而，气道小丘的具体功能仍不清楚。
麻省总医院领导的研究团队近日深入鉴定了气道小丘的功能。他们发现，小丘基底干细胞能不断补充表面上覆盖的鳞状屏障细胞。此外，由于小丘鳞状细胞能够保护下层的基底干细胞免受损伤，小丘结构对各种严重损伤具有广泛的抵抗力。在气道损伤后，这些基底干细胞能重新覆盖气道表面，再生出正常的气道上皮细胞。
这篇题为“Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells”的论文于2024年5月1日发表在《Nature》杂志上，重塑了我们对气道上皮再生的认识。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员使用了多个小鼠模型进行谱系追踪，其中KRT13-CreER driver小鼠由赛业生物提供。他们利用单细胞RNA测序对小丘上皮和假分层上皮进行了分析，并采用多个损伤模型来评估小丘结构对损伤的抵抗力，包括萘损伤模型。他们还开展了气管移植培养，并采用共聚焦显微镜和双光子显微镜来观察培养物。
技术路线
01
通过免疫染色、扫描电镜和谱系追踪等分析来确定小丘的分层结构
02
利用多个损伤模型来评估小丘抵御各种环境损伤的能力
03
利用萘损伤模型来评估小丘对组织修复的贡献
04
利用小鼠模型确定小丘扩增是维生素A缺乏诱导鳞状上皮化生的原因
研究结果
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小丘具有鳞状管腔细胞
研究人员发现，小鼠小丘约占气管管腔表面的2.5%。纤毛状气道上皮的经典特征是假分层，其中所有上皮细胞都与下层基底膜保持接触。然而，小丘似乎是真正的分层结构，其特点是KRT13的表达呈梯度变化，管腔细胞表达量最高，而基底细胞表达量最低（图1）。
扫描电镜的图像分析显示，小丘符合严格的细胞分层标准，其管腔细胞不与基底膜接触，是真正的鳞状细胞（图1）。让人惊讶的是，小丘还是稀有细胞的荒漠，缺乏气道上皮特有的其他稀有上皮细胞，包括离子细胞、簇细胞和神经内分泌细胞。这些结果表明，小丘是一种屏障结构，由分层且交错的鳞状细胞组成，它们位于基底干细胞层之上。
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小丘含有不同的基底干细胞
之后，研究人员利用TRP63-CreER driver对小丘上皮的基底干细胞进行谱系标记（Trp63是基底干细胞的标志物基因）。他们发现，在三周后，整个小丘区室都被谱系标记，表明小丘管腔细胞即使在稳态期间也会被底层的基底干细胞迅速取代。
他们之前发现，小丘管腔细胞表达了分泌细胞的标志物Scgb1a1。为了评估Scgb1a1+小丘管腔细胞是否有别于传统的分泌细胞，他们开展了差异基因表达分析。结果显示两个细胞群的基因集完全不同。利用KRT13-CreER driver小鼠（由赛业生物提供），他们发现小丘管腔细胞在注射IL-13后没有分化成杯状细胞，与传统的分泌细胞不同。
接下来，研究人员将重点放在小丘基底细胞上，看看它们与假分层的基底干细胞是否相同。利用与ifgMosaic报告基因小鼠交配的TRP63-CreER driver小鼠，他们对基底干细胞进行了谱系标记。三个月后，位于假分层上皮的基底干细胞产生了小克隆（含有不到15个细胞），而小丘内的基底干细胞产生了大克隆（多达60个细胞），表现出大规模的克隆扩增。
由此可见，小丘是一种持续存在的分层鳞状组织结构，不包含稀有的上皮细胞类型。此外，小丘基底干细胞具有独特的增殖能力，低水平表达与鳞状细胞分化相关的基因。在稳态期间，它们主要生成了快速周转的鳞状细胞，对周围的假分层上皮也有少量贡献。
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小丘能抵御各种损伤
由于小丘中紧密交错的鳞状细胞可以作为物理屏障，研究人员接着评估了小丘抵御各种环境损伤的能力。将气管浸泡在盐酸内2分钟以模拟胃酸吸入后，大部分存活细胞为小丘细胞。即使在损伤最严重的小丘中，管腔细胞已经凋亡，但底层的基底干细胞仍能免受损伤并存活下来（图2）。除了抵御物理损伤，小丘对流感病毒感染也有显著的抵抗力（图2）。
为了确定小丘对组织修复的贡献，他们采用了毒性气道损伤的标准化模型，将小鼠暴露于萘（烟草烟雾毒素）中。他们利用活体成像技术直接观察谱系标记的基底干细胞的行为，发现存活细胞的分布与小丘的分布一致，且均为KRT13+。在5天时间内，存活的细胞及其后代逐渐重新覆盖了损伤气管的表面。到损伤后第10天，KRT13+细胞遍布气管上皮，并显示出纤毛逐渐生成的迹象。
为了验证小丘是否是纤毛上皮的来源，研究人员利用KRT13-CreER driver小鼠对小丘进行了谱系标记。结果证实，覆盖气管表面的细胞来源于小丘。重新覆盖的上皮表现出可塑性，并转化为纤毛上皮。此外，尽管小丘本身缺乏稀有上皮细胞，但来源于小丘基底干细胞的气道上皮包含所有类型的稀有气道上皮细胞。通过dual-ifgMosaic克隆谱系追踪，他们发现在萘损伤后存活的基底细胞能够大规模克隆扩增，并生成所有六种类型的上皮细胞。
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小丘是鳞状上皮化生的起源之一
在比较小丘基底细胞和假分层基底细胞的转录组后，研究人员发现一种用于视黄酸分解的酶（Cyp26b1）在小丘基底细胞中特异性上调。在低温损伤模型中，当视黄酸受体拮抗剂Agn193109存在时，KRT13-CreER谱系标记的气道表面上皮比例明显增加。基因表达分析表明视黄酸代谢在小丘基底细胞中的处理方式不同，因此他们推断，小丘基底细胞对视黄酸信号抑制更敏感，因为它们已准备好分解视黄酸。
人类鳞状上皮化生是在缺乏维生素A的情况下发生的，表明小丘基底干细胞对维甲酸信号抑制的功能反应可能与病理有关。研究人员使用了维生素A缺乏诱导的小鼠鳞状上皮化生模型，发现小丘斑块在2个月内增大了一倍多。为了确定鳞状化生性病变是否是小丘扩增的结果，他们进行了KRT13-CreER谱系追踪，发现鳞状化生斑块来源于小丘。这些结果表明，这种形式的鳞状上皮细胞化生是小丘扩增的结果，而不是假分层上皮的化生转化。
研究结论
这些结果表明，小鼠和人类小丘是独特而稀有的干细胞库，对各种损伤具有广泛的抵抗力。这些干细胞能够进行大规模克隆扩增，重新覆盖气道表面，形成临时屏障上皮，然后表现出可塑性，分化成气道上皮的所有六种细胞类型。研究还发现，小丘是“鳞状上皮化生”的起源之一，而这被认为是鳞状细胞癌的前兆。
参考文献：
[1]Lin, B., Shah, V.S., Chernoff, C. et al. Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells. Nature 629, 869–877 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07377-1