食道鳞状细胞癌(ESCC)是世界上常见的一种恶性肿瘤，其发生发展经历了从正常上皮到上皮内瘤变再到浸润性癌的过程。上皮内瘤变根据其鳞状细胞厚度的不同，可分为两级，即低度上皮内瘤变(LGIN)和高度上皮内瘤变(HGIN)，尽管恶性上皮病变的表型和形态在组织病理学上是清楚的，但上皮内瘤变如何发展为ESCC以及潜在的分子机制在很大程度上尚不清楚。
本研究通过单细胞转录组测序和空间转录组测序技术发现了上皮细胞中的ANXA1和成纤维细胞上的FPR2之间的信号转导在癌症相关的成纤维细胞（CAFs）形成过程中的作用，揭示了ANXA1/FPR2信号是上皮细胞和成纤维细胞之间促进ESCC的重要串扰机制。接下来我们就一起来看看这一研究吧!
上皮细胞激活成纤维细胞来促进食道癌的发展
Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development
期刊：Cancer Cell
影响因子：48.8
发表时间：2023.03
研究背景
癌症的发生和发展是通过微环境中一系列复杂的间质细胞类型来实现的，研究表明，晚期ESCC肿瘤微环境中有大量的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)，说明CAFs的形成可能是ESCC发展中的一个过程。因此，正常的成纤维细胞(NFs)是如何转变成CAFs的问题，在肿瘤发生过程中的十分重要。该文章将空间转录组测序和单细胞转录组测序技术相结合，发现，ANXA1在癌前和恶性上皮细胞中的表达受到抑制，ANXA1作为正常食道上皮细胞产生的一种配体分子，通过与NFs上的FPR2受体相互作用来控制和维持NFs的动态平衡。ANXA1表达的降低，导致癌前/恶性上皮细胞和成纤维细胞之间ANXA1-FPR2信号的减少，从而允许并促进了NFs向CAFs转化。本文揭示了食道癌TME中CAFs激活的新机制。
主要结果
1. 单细胞转录分析揭示多阶段ESCC肿瘤发生中的不同细胞类型
研究人员对来自29例ESCC患者的79例食道样本进行了scRNA-seq，包括45例正常食道（NOR），9例LGIN，9例HGIN，以及16例肿瘤组织。最终得到7种主要细胞类型，即上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞，且这些细胞类型的组成在不同的疾病阶段表现不同。进一步将每种主要细胞类型划分为亚型，得到了8种不同表达程序的上皮细胞亚型，包括静止祖细胞(QP)、循环(CY)、粘膜防御(MD)、终末分化(TD)、缺氧相关应激(HY)、活性氧相关应激(RS)、还原(DO)和抗原呈递(AP)。其中，在NOR和LGIN期的上皮细胞中，25%以上的细胞高度表达MD程序，而在HGIN和ESCC期，该细胞亚型的比例下降到6%以下，这表明MD程序在维持正常的食道上皮细胞表型方面发挥着重要作用。
超过95%的NOR和LGIN阶段成纤维细胞被鉴定为NFs。CAFs出现在HGIN阶段，并且占ESCC总成纤维细胞的63%。以表达IGFBP3为特征的内皮细胞亚型(Endo-IGFBP3)在ESCC中增加到50%，但在NOR期、LGIN期和HGIN期分别仅占内皮细胞总数的25%左右。
5种免疫细胞类型的比例在ESCC肿瘤发生的不同阶段也有所不同。虽然B细胞的比例从NOR的27%下降到ESCC的16%，但在LGIN(43.2%)和HGIN(47.0%)中却有所增加；虽然ESCC中CD8+ T细胞的比例(51.3%)明显高于NOR(26.7%)，但NOR、LGIN(26.1%)和HGIN(24.3%)中CD8+ T细胞的比例相似。CD4+ T细胞的比例在4个阶段都差不多(分别为18.8%、17.1%、14.6%、15.4%)，骨髓细胞的比例在NOR(20.1%)中略高于LGIN(11.5%)、HGIN(12.9%)和ESCC(15.6%)，但差异无统计学意义。在LGIN、HGIN和ESCC中，只有肥大细胞的数量随着肿瘤的进展而显著减少，但它们仅占总免疫细胞的一小部分。总之，这些结果似乎表明微环境中免疫细胞群的变化可能是ESCC肿瘤发展过程中的晚期事件。
图1 单细胞转录分析揭示多阶段ESCC肿瘤发生中的不同细胞类型
2. 单细胞转录分析揭示多阶段ESCC肿瘤发生中的不同细胞类型
进一步探讨了不同疾病阶段上皮细胞的组成和转录变化。分析显示，在ESCC发展过程中，具有QP、CY、MD、TD四种表达程序的上皮细胞占正常上皮细胞的88.1%；然而，在ESCC肿瘤中，表达这些程序的细胞百分比下降到43.1%。相比之下，在ESCC发展过程中，表达其他四种癌症相关程序(包括HY、RS、DO和AP)的上皮细胞比例从9.8%增加到56.9%。在ESCC的发展过程中，最显著的表达变化是程序MD的急剧下降(从NOR的29.8%下降到LGIN的26.8%，HGIN的5.8%和ESCC的3.0%)。这些结果表明，MD功能的丧失可能是导致正常上皮细胞转变为恶性状态并形成侵袭性 ESCC 的关键步骤。
随后，作者想在MD过程中寻找可能驱动ESCC从癌前病变发展的基因，最终选择了在MD过程中具有代表性的基因之一——ANXA1，该基因在正常人食道组织中高度特异性表达，但在ESCC早期发病中被抑制。研究发现ANXA1的表达水平从NOR到LGIN, HGIN,ESCC逐渐下降，空间转录组和ANXA1的免疫组化染色也证实了这一分析结果。这些结果说明ANXA1的功能丧失可能是ESCC肿瘤发生的关键机制。
图2 食道鳞状癌发生过程中上皮细胞ANXA1表达的渐进性抑制
3. 上皮细胞中ANXA1的抑制促进NFs转化为CAFs
成纤维细胞构成了食道间质的大部分，如果被癌细胞激活，在癌症的发展中起着重要的作用。作者发现在ESCC的发展过程中，成纤维细胞表现出表型的改变。在成纤维细胞中鉴定了三个表达SLPI(NF-SLPI)、CCN2(NF-CCN2)、APOE(NF-APOE)的NFs，以及两种CAF类型，即炎症性CAFs(iCAFs)和肌成纤维母细胞CAFs(myCAFs)。NFs的三种亚型主要存在于正常食道组织中，但从LGIN到HGIN和ESCC逐渐减少，而CAFs的两种亚型仅存在于HGIN和ESCC，说明CAFs的激活最早出现在HGIN阶段。NF-SLPI亚型代表了表达细胞外基质(ECM)相关基因的成纤维细胞，而NF-CCN2和NF-APOE亚型则表现出活跃的细胞聚集和伤口愈途径。iCAFs高表达一些趋化因子产生途径相关的基因，而myCAFs高表达与ECM重塑和降解相关的基因。通过成纤维细胞状态转变的轨迹发现，CAFs的激活轨迹从NF-SLPI亚型开始，通过NF-CCN2到iCAFs，最终到myCAFs，而NF-APOE通过一个较小的轨迹作为NFs亚集被激活。这些结果表明，在ESCC的形成和发展过程中，微环境中的NFs早在HGIN甚至LGIN的发病阶段就被激活为CAFs。
随后作者研究了ESCC肿瘤发生过程中的上皮-成纤维细胞的相互作用。结果表明，在八个上皮程序中，只有MD程序与NF显著正相关，但与iCAF和myCAF显著负相关。进一步研究发现ANXA1的RNA水平与NF呈现显著的正相关，但与iCAF和myCAF呈现显著的负相关。空间转录组的结果进一步验证了ANXA1与NF活性呈正相关，与CAF活性呈负相关。这些结果表明食道上皮细胞产生的ANXA1可能通过上皮-成纤维细胞相互作用在控制微环境NFs中发挥重要作用，上皮细胞中ANXA1功能的丧失可能导致NF-CAF转化。
图3 上皮细胞中ANXA1的抑制促进NF转化为CAF
4. ANXA1的缺失通过减弱其与FPR2的相互作用来促进myCAF的激活
接下来，作者研究了ANXA1的抑制如何促进NF-CAF转化。免疫染色和组织病理学特征图像结果进一步证实了NFs和CAFs之间的相关性和潜在的相互作用。然后，作者建立了ANXA1缺失(KO)或过表达(OE)的ESCC和正常食道上皮细胞系，并将它们与NFs共培养。结果表明，与对照相比，NFs与ANXA1缺失的ESCC细胞共培养时，NFs具有更高的迁移能力，但是与ANXA1-OE的ESCC细胞共培养时，其迁移能力明显低于与对照组。与相应的对照组相比，在NFs和ANXA1-KO共培养中，myCAF激活标志物一致上调，与ANXA1-OE细胞共培养时持续下调，但在体外实验环境中，未检测到与iCAF相关的标志物的变化。此外，在 NFs 和 ESCC 的共培养基中添加重组人 ANXA1 蛋白 (rANXA1) 可显著抑制 myCAF 活化，这种抑制效果与ANXA1-OE和 ESCC细胞共培养时的效果相同，并且呈剂量依赖性。
接下来，又研究了ECSS细胞中ANXA1表达的变化是否会影响与食管组织样本中分离的NFs共移植或不移植的小鼠肿瘤异种移植的生长速度。结果显示，KYSE30细胞加NFs的异种移植物的生长速度显著高于仅ESCC细胞的异种移植物，这表明CAFs可能会促进ESCC的发展。
图4 ANXA1的抑制促进myCAF在体外和体内的激活
然后，作者想要寻找ANXA1影响NFs向myCAFs转化的作用机制。先前的研究表明，ANXA1可能作为一种配体与甲酰基肽受体(FPR)家族结合，因此作者进行了免疫共沉淀试验，发现ANXA1特异性地结合FPR2。免疫荧光分析显示rANXA1和FPR2共定位在NF和CAF的细胞膜上，进一步支持了这种配体-受体的相互作用。作者还观察了ANXA1-FPR2结合中断后NFs向myCAFs转化过程中的功能变化，发现当FPR2基因敲除的NFs与ANXA1-OE的ESCC细胞共同培养时，myCAF激活标志物的表达水平显著增加，这表明ANXA1通过与NFs中FPR2的配体-受体相互作用控制了NFs向myCAFs的转化。
进一步研究抑制NFs向myCAFs的转化的ANXA1-FRP2信号的下游效应因子，发现ANXA1-FPR2相互作用抑制了AKT、ERK和SMAD3的磷酸化，同时myCAF标志物FAP、VIM、MMP1和α-SMA水平的显著下降。当用rANXA1或ERK (SCH772984)、AKT (MK-2206)和SMAD3 (SIS3)抑制剂治疗NFs时，也出现了类似的变化。
CAF激活剂TGF-β通过ERK/AKT和SMAD3信号通路激活myCAF标志物FAP, VIM, MMP1和α-SMA，这表明TGF-β是在癌症微环境中控制NFs的ANXA1拮抗剂。尽管ANXA1与TGF-β作用的下游分子模块可能相似，但TGF-β对NFs向myCAFs转化的影响不依赖于FPR2。最后，作者研究了ANXA1在抑制致癌物4-NQO诱导的小鼠ESCC模型中的潜在功能，对小鼠注射Ac2-26(一种结合FPR受体的ANXA1模拟肽) 5周后，分析显示，Ac2-26治疗组的癌前病变和肿瘤与对照组小鼠相比显著减轻，这进一步支持了ANXA1在抑制ESCC中的重要作用。
图5 ANXA1的缺失通过减弱其与FPR2的相互作用来促进myCAF的激活
5. ANXA1的功能丧失是由其转录因子KLF4的抑制引起的
接下来，作者研究了为什么在ESCC肿瘤发生过程中ANXA1的表达减少了。通过对四个公共数据库进行分析，得到了11个ANXA1的候选转录因子（TF）。然后，分析了scRNA-seq数据中这些TF和ANXA1表达水平之间的相关性，结果表明有四个潜在的TF（KLF4，KLF5，CEBPB和FOXA1）与ANXA1 RNA水平显著正相关。通过scRNA-seq和免疫组织化学染色，发现KLF4的RNA和蛋白水平从LGIN、HGIN到ESCC均显著低于NOR，且ANXA1 RNA与KLF4 RNA水平呈显著正相关。HET-1A和KYSE450细胞的基因敲除分析表明，在四种转录因子中，只有靶向KFL4的siRNAs显著抑制ANXA1的表达。EMSA分析证实KLF4可以特异性地与ANXA1启动子序列结合。染色质免疫沉淀结定量聚合酶链式反应分析表明，在HET-1A、KYSE450和KYSE30细胞中，KLF4抗体都能显著富集ANXA1。综上所述，这些结果表明KLF4作为一种转录因子，可以正向调节食道上皮细胞中ANXA1的表达。
最后作者进行了体外实验，来探索KLF4表达状态对CAF迁移和激活的影响。结果表明，沉默KLF4可显著增强CAF的激活和迁移，而恢复ANXA1可以显著抑制沉默KLF4引起的CAF激活和迁移。作者还对正常食管标本中的KLF4和ANXA1蛋白进行了免疫荧光染色，结果显示这两个分子共定位，并且呈正相关。这些结果进一步证实了KLF4可以调控ANXA1的转录，ANXA1可以调控NF向myCAF的转化。
图6 ANXA1的功能丧失是由其转录因子KLF4的抑制引起的
结论
众所周知，CAFs在肿瘤的多步发展过程中起着关键作用。然而，微环境中的恶性细胞何时以及如何将NFs转变成CAFs在很大程度上仍不清楚。本研究通过scRNA-seq，破译了不同癌前病变和恶性病变微环境中的细胞组成。通过分析同一个体的正常上皮、癌前病变和ESCC样本，发现MD程序的表达水平随着ESCC的发展而逐渐显著降低，说明上皮细胞MD功能丧失是ESCC发生发展的早期事件，并且这个程序中的代表性基因ANXA1被证实在食道癌的早期发生时的表达被抑制。通过对ANXA1进一步研究发现ANXA1抑制ESCC发展的作用机制是它与FPR2通过配体-受体的方式在成纤维细胞上相互作用。本研究还发现KLF4可以正向调节ANXA1的表达。这一结果说明，KLF4可能是ANXA1-FPR2信号的上游关键因子，并在ESCC的发生发展中发挥关键作用。总之，本研究基于scRNA-seq、空间转录组学、功能分析和动物实验，揭示了ESCC通过上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用从癌前病变发展的重要机制，该结果可能对了解癌症的发展、食道鳞状癌的预防和临床治疗具有深远的意义。
参考文献
Chen Y, Zhu S, Liu T, et al. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 2023 May 8;41(5):903-918.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.001.
王甜甜 | 文案
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