正在做Co-IP实验的小伙伴不要走！
Co-IP实验标准操作全流程、实验结果图解读、实验常见问题分析&解决、实际应用场景等 ，一文帮助大家掌握免疫共沉淀技术。
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一、Co-IP实验原理
1、原理解析
说到Co-IP（免疫共沉淀）实验原理，就不得不提到IP（免疫沉淀）了：IP是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行亲和纯化的方法。基本原理是抗原-抗体特异性结合，检测目的是富集分离蛋白。
Co-IP是IP的延伸，主要是用于探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。基本原理也是抗原-抗体特异性结合，检测目的是蛋白间相互作用。
2、Co-IP优缺点
Co-IP优点：
操作流程较为简便，不需要事先制备大规模蛋白表达文库；
可以研究具有修饰的目的蛋白；
能够对间接相互作用的蛋白进行捕获，比如对蛋白复合物的多种成分进行鉴定。
Co-IP缺点：
检测不到低亲和力和瞬时的互作；
不能判断直接互作或是间接互作；
需要再实验前预测目的蛋白，已选择特异的检测抗体。可以提前预测是否互作（蛋白相互作用验证数据库：NCBI、UniProt、GeneCards、STRING）；
有可能因为多种非特异性吸附带来假阳性结果，因此需要严格的对照；
缺少组织特异性。
二、Co-IP标准化操作流程
1、样品裂解-裂解液；
2、样品的预纯化-normal IgG/微珠；
3、与目标蛋白抗体共孵育-IP抗体、Normal IgG；
4、免疫共沉淀-微珠；
5、微珠清洗-裂解液；
6、洗脱；
7、WB 分析或其他分析-WB一抗、二抗。
1、样品裂解-温和裂解
温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS；
成品buffer推荐：CST/9803S，Merck Millipore/20-188；
添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）：Merck Millipore/539134。
样本制备流程：
去掉培养基，用冰PBS清洗一次；
去掉PBS，每个板（10cm）中加0.5mL冰预冷的1X细胞裂解液，在冰上孵育5min；
将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上；
冰浴中对样品用超声处理3次，每次5秒钟。（此步骤对膜蛋白提取有较好作用）；
4 ℃，14000xg离心10min，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物；
BCA测定浓度。
注意事项：
整个过程需要在冰上操作；
IP样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要可保存在-80 ℃。
2、预纯化
阴性对照的选择：
与IP抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG；Mouse IgG1, etc；
取与IP实验等量的裂解液，使用Isotype Control孵育；与IP抗体孵育同时进行。
Isotype Control选择：
预纯化的目的：
减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
同时减少了可能与Protein A/G发生交叉反应的蛋白含量。
根据IP实验结果，可以调整每次IP的总蛋白用量。
预纯化流程：
取200 μL 1 mg/mL的细胞裂解物与30μL 50%的PreteinA/G微珠（琼脂糖或磁珠）混合，4 ℃孵育30-60min；
通过离心或者磁性分离去除微珠；
留取上清进行后续实验。
3、共孵育（抗体+蛋白）
根据实验条件，对应选择适合的孵育方法。
方法一：样本与目标蛋白的共孵育
IP抗体+裂解液→加入Protein A/G→Wash→Elution；
【特点】得率及蛋白纯度最高
方法二：抗体与微珠的共孵育
IP抗体+ProteinA/G→Wash→加入裂解→Wash→Elution；
【特点】当抗体不够纯时，使用此方法，先去除抗体的非特异性结合。
方法三：抗体+微珠+裂解液共孵育
IP抗体+ProteinA/G+裂解液→Wash→Elution；
【特点】可能导致微珠和样本的非特异性结合；优点是孵育时间较快。
共孵育流程：
向蛋白裂解液中加入适量一抗。抗体量及终浓度要通过预实验（梯度稀释）或者查阅文献和说明书来确定；不要加太多的一抗，否则背景较高；
4 ℃翻转孵育过夜；
平行样本：使用合适的Isotype Control。
4、共沉淀
一般来说蛋白G比蛋白A结合IgG的范围更宽广；结合 IgG 的力度更强劲。
蛋白A/G是一种结合了四种蛋白A和两种蛋白G抗体结合位点的工程改造重组蛋白。
所有分别能与蛋白A和G结合的抗体亚类均可与蛋白A/G结合。
不同蛋白亲和力评估表：
琼脂糖珠VS磁珠对比：
琼脂糖珠：背景高，需要封闭；需要离心，操作繁琐；容易吸走珍贵样品。
磁珠：无需离心，缩短操作时间；磁珠表面光滑、背景低，无需封闭；带颜色，磁珠吸到管壁，不易被吸走珍贵样品。
共沉淀流程：
Day2，加入30 μL 50%的Protein A/G珠子（200-500 μg蛋白 ）。建议将枪头去剪，防止加Protein A/G 时损伤珠子；
4℃翻转孵育1-3h；
很多情况下，抗体孵育和免疫共沉淀步骤合并，直接加入固定化抗体（与微球偶联），在4 ℃孵育过夜。
5、清洗
清洗目的：
洗去非特异性结合。
Wash buffer：
盐离子浓度和去垢剂种类、浓度不同，造成洗涤的严格度不同
RIPA：洗涤严格度高，用于蛋白富集或翻译后修饰分析；
Cell lysis buffer：Co-IP
PBS：严格度最低，用于蛋白复合物分析
清洗流程：
加入500 μL Wash buffer；
重悬，颠倒数次；
4 ℃离心，弃上清；
重复4-5次。
6、洗脱
洗脱目的：
将蛋白从珠子上洗脱
变性洗脱与非变性洗脱：
洗脱流程：
加入3XSDS buffer 20-30μL，震荡、离心；
煮样2-5min，14000x g离心1min；
取上清上样15-30μL；
样品可储存于-80 ℃。
7、WB免疫印迹分析
对照设置以及结果解读：
Input：阳性对照，全蛋白组
Preimmune：阴性对照，IgG组
anti-TBP/TDF：实验组，IP组
【补充】重链/轻链污染该如何选择抗体？
IP检测产生轻重链原因：
完整抗体=2条重链（~55KD/重链）+2条轻链（~25KD/轻链），抗体变性后，就会产生一个55KD的重链蛋白，1个25KD的轻链蛋白，WB检测IP的样本时，由于二抗也识别结合一抗的轻重链，导致WB曝光时会产生对应的55KD与25KD分子量的条带。
轻重链条带干扰如何避免：
方案一：选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；
方案二：选择特殊二抗；
①选择只识别结合一抗空间表位的特殊二抗，一抗若变性成为了重链和轻链，该二抗是不结合的，WB结果能避免曝光出55与25KD的轻重链条带，可参考Genscript,abcam对应特殊二抗产品。
② 如果目标蛋白分子量小于30KD，为了避免抗体轻链的干扰，可参考选择重链特异性二抗，这时的结果会只有55KD的重链曝光条带。
③如果目标蛋白分子量大于30KD，为了避免抗体重链的干扰，可参考选择轻链特异性二抗，这时的结果会只有55KD的重链曝光条带。
方案三：标签类（Flag，HA，GFP，myc等）IP通过过表达方式，将目标IP蛋白带上Flag，HA，GFP，myc等标签，可极大方便后续的实验检测。
①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠，IP实验会比较容易操作，由于标签抗体非常成熟，IP抗体与WB抗体选择不同种属来源，即可避免轻重链问题。
②WB选择直接HRP标记的标签抗体（如Flag-HRP mab），不需要二抗孵育步骤，可完全避免轻重链问题。
③羊驼标签beads（也称纳米抗体beads），由于羊驼抗体结构的特殊性，可完全避免IP上的轻重链问题，劣势是成本较高。
8、实验过程回顾
三、Co-IP实验图怎么看
在分析Co-IP结果图时，我们需要关注图中各个部分所代表的实验步骤，并结合实验结果进行综合分析。通过这样的分析，我们可以得出实验的结论，并进一步理解Co-IP实验结果的意义。因此，熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及操作流程是进行Co-IP结果图分析的关键。
文献案例1
该图为验证蛋白EDR1与蛋白EDR4之间是否存在相互作用的结果图。
由图中可以得到：蛋白EDR4带有GDP标签，蛋白EDR1带有FLAG标签，该实验为利用蛋白标签来沉淀和检测蛋白。
该Co-IP实验实验被分为两组，第一组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋白，第二组存在EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白；图中共有三组胶图，分别是Input组，IP组，以及Co-IP组。
观察图片的顺序为Co-IP实验操作顺序相同。
首先观察Input组，即阳性独照组。第一块胶图为利用anti-FLAG沉淀FLAG标签，发现两个条带都在130kd处有蛋白，说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋白且其大小为130kd，第二块胶图为利用anti-GFP标签沉淀GFP标签，发现第一条带在25kd存在蛋白而第二条带在130kd存在蛋白，说明第一组实验存在GFP标签，且大小为25kd，第二组实验存在EDR4-GFP蛋白且大小为130kd。
随后观察IP组，该组图表示的是利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀，图上显示两组实验在130kd都存在蛋白，说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。
最后观察Co-IP实验组，该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签，图上显示第一组实验没有条带，而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共沉淀下来，但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来了。说明EDR1-FLAG蛋白不能与GFP标签相互作用，但是可以与EDR4-GFP蛋白相互作用。
由此可得到结论：EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用。
文献案例2
该图为验证蛋白ChREBP与蛋白HDAC1之间是否存在互作的结果图。
蛋白ChREBP带有FLAG标签，蛋白HDAC1带有Myc标签。该实验是利用标签抗体去沉淀及检测带有标签的蛋白。
该实验共有三组：
第一组为加Myc-HDAC1不加FLAG-ChREBP；
第二组为加FLAG-ChREBP不加Myc-HDAC1；
第三组为两个都加。
实验共有四张胶图，分别为IB：Myc、IB：FLAG（这两张胶图为阳性对照），IP：FLAG IB：FLAG（IP组），IP：FLAG IB：Myc（Co-IP组）；
最下面两个胶图为利用IB验证Myc-HDAC1及FLAG-ChREBP存在的阳性对照。
第二张胶图表示的实验操作是利用anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白，图上显示经IB验证第二、第三组FLAG-ChREBP蛋白被成功沉淀下来，而第一组没有结果（第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白）。
第一张胶图表示在anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白的基础进行IB检测验证Myc-HDAC1蛋白是否存在。图上显示第一、第二组实验没有检测到（第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白，第二组不存在Myc-HDAC1蛋白），但是第三组实验检测到了Myc-HDAC1蛋白。
由此可以得到结论：两个蛋白都存在的时候，当FLAG-ChREBP蛋白被沉淀，Myc-HDAC1蛋白也会被共沉淀下来，ChREBP蛋白与HDAC1蛋白之间存在相互作用。
文献案例3
该图为验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用的结果图。
由图可以发现，该实验被分为两组：input组及IP组，有两块胶图，第一块是IB验证蛋白X的存在，第二块是IB验证蛋白Y的存在。
由对照组的条带可以得到结论：蛋白X与蛋白Y都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验，结果蛋白X与蛋白Y没有被沉淀下来，说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合（阴性对照，用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性）；IP组的第二条带表示利用蛋白X进行沉淀实验，结果蛋白X被沉淀下来，蛋白Y也被沉淀下来。
由此得到结论：蛋白X-蛋白Y之间存在相互作用。
文献案例4
该图为验证CAT3蛋白与CPK8蛋白之间存在相互作用的结果图。
由图可以得到，两个蛋白分别加了标签，利用标签进行蛋白的沉淀及检测。
实验共分三组：
第一组为存在GFP-CAT3，不存在cMyc-CPK8；
第二组为存在cMyc-CPK8不存在GFP-CAT3，
第三组为两个都存在。
实验共有两组胶图，一组为阳性对照组（Input组），另外一组为实验组（Output组）。由Input组可以得到结论：三组实验中的组分都是正确的。
分析Output组发现：
anti-cMyc在第二、第三条泳带都有，而anti-GFP只有第三条带有蛋白，由此推测实验组的实验操作为利用anti-cMyc进行沉淀实验，在利用IB检测GFP-CAT3的存在。
从实验组第三条带可以发现当cMyc-CPK8蛋白被沉淀下来时GFP-CAT3蛋白也会被共沉淀下来，由此得到结论：cMyc-CPK8蛋白与GFP-CAT3蛋白存在相互作用。
四、Co-IP常见问题以及解决方案
1、高背景
可能原因：制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体。
对应解决：制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），离心纯化，取上清进行后续实验。
可能原因：洗涤不彻底。
对应解决：多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度。
可能原因：非特异性蛋白吸附于磁珠上。
对应解决：进行预处理以防止非特异性吸附。
可能原因：抗体本身特异性不好。
对应解决：选择合适的抗体，可以考虑单抗。
可能原因：使用了太多的抗体。
对应解决：进行条件优化减少抗体。
可能原因：使用了过多的细胞或组织用于裂解。
对应解决：减少细胞或组织量，推荐使用100-500 μg细胞裂解物。
可能原因：抗原降解。
对应解决：保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。
2、无信号
可能原因：目的蛋白在样本中表达量低或者不表达。
对应解决：首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。
可能原因：细胞裂解液使用不当。
对应解决：根据实验需要选择，慎重考虑。
可能原因：目的蛋白未被洗脱。
对应解决：保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和PH值合适。
可能原因：抗原降解。
对应解决：保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。
可能原因：抗体没有很好的与微珠相互结合。
对应解决：选择合适的微珠。
可能原因：抗体选择不当或者不工作。
对应解决：利用WB对抗体进行验证。
可能原因：抗体使用不足。
对应解决：查阅文献或者说明书，并多次优化或选择合适的抗体使用量。
3、假阳性
假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下所示：
4、免疫共沉淀实验失败原因
可能原因：样品被蛋白酶降解。
对应解决：添加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)；所有操作保持 4℃以下冰上操作并防止冻融。
可能原因：抗体浓度太低。
对应解决：调整 IP 和/或 IB 抗体浓度， 必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。
可能原因：抗体亲合力太低。
对应解决：选用适合于 IP 和/或 IB 的相应抗体。
可能原因：IP 抗体未与珠子结合。
对应解决：选用适合于 IP 的相应珠子， 正确保存防止变质或干燥。
可能原因：Tag未暴露在融合蛋白构象的表面。
对应解决：改变 tag 融合表达部位。
可能原因：裂解液严谨度太高。
对应解决：改用低严谨度裂解液。
五、Co-IP应用场景
①利用质谱鉴定相互作用蛋白
Ref：Liu, K. , et al. Developmental Cell 50.4(2019):509-524.e10.
Ref：Gao, F. , et al. Journal of Biological Chemistry 284.33(2009):22263-22273.
②缺失分析联合Co-IP进行蛋白互作结构域分析
Ref：Chouin, et al. eLife 7(2018).
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