大家好呀！有关铁死亡这一国自然热点，想必大家已经阅读过很多研究了，不知道各位小伙伴们吸收领悟以及复现得怎么样了呢？如果现在还不能愉快地在铁死亡的领域中畅游也没关系，再多多练（yue）练（du）技（wen）巧（xian）成为大牛就指日可待！正所谓台上一分钟，台下十年功，想要登台发文，就要多跟着小薇阅读文献、学习研究思路喔！今天小薇想跟小伙伴们分享的这篇文章推陈出新，将铁死亡与神经免疫相结合，旨在阐明铁死亡在神经元死亡中的作用，发表在Molecular Neurodegeneration（IF=15.1）上：
1，本研究采用小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的共培养和条件培养基转移实验，来阐明铁死亡在神经元死亡中的作用；
2，本研究通过评估来自肌萎缩侧索硬化症（ALS）致死性麻痹性神经退行性疾病病例的人CNS组织，证实了细胞培养结果的临床意义；
3，本研究利用SOD1G37R小鼠ALS模型和CNS渗透性铁死亡抑制剂来验证体内药理学意义。
铁死亡看似已经是“老生常谈”，但其实热度不减，仍旧是发文的好方向，想要发表高分SCI的小伙伴们也可以借鉴一下本文的研究思路哦~(ps：不知道怎么创新的小伙伴可以来找小薇！这里有新鲜出炉的医学热点方向，还有一大波的可复现的创新思路，感兴趣的直接来公众号后台找我噢！)。
题目：小胶质细胞铁死亡应激引起非细胞自主性神经元死亡
杂志：Molecular Neurodegeneration
影响因子：IF=15.1
发表时间：2024年2月
公众号后台回复“123”，即可领取原文，文献编号-240513-1
研究背景
铁死亡是一种受调节的细胞死亡形式，其特征在于以脂质过氧化作为终点和对铁的需求。虽然它可以防止癌症和感染，但铁死亡也涉及引起中枢神经系统（CNS）退行性疾病中的神经元死亡，而它在引起神经元死亡中的确切作用尚未完全解决。
数据来源
本研究使用的ALS病人腰脊髓的冷冻切片来自维多利亚脑库（澳大利亚）、MS Society Tissue Bank（英国）、MRC伦敦神经退行性疾病脑库（King’s College，伦敦，英国）、马里兰州大学脑和组织库、NIH NeuroBioBank的生物库（马里兰州，美国）和悉尼脑库。
研究思路
研究者利用了涉及小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的共培养和条件培养基转移实验，来阐明铁死亡在神经元死亡中的作用。通过评估来自肌萎缩侧索硬化症（ALS）致死性麻痹性神经退行性疾病病例的人CNS组织，证实了细胞培养结果的临床意义。利用SOD1G37R小鼠ALS模型和CNS渗透性铁死亡抑制剂来验证体内药理学意义。
主要结果
1. 铁死亡的标志物在人类散发的ALS受累组织中很明显
研究者使用激光消融-电感耦合等离子体质谱来确定散发性ALS病例中铁的解剖分布，并发现ALS中脊髓灰质内的铁积累，特别是在运动神经元所在的腹侧和侧灰质区域（图1a, b）。这些铁的变化伴随着铁氧化酶活性的降低（图1c），以及与铁处理相关的基因表达的改变（图1d, e），表明肌萎缩侧索硬化症患者体内铁平衡紊乱。此外，谷胱甘肽作为GPX4铁死亡检查点功能的底物，在ALS患者组织中浓度显着降低（图1f）。这与ALS受影响组织中脂质过氧化作用升高有关（图1g），也与铁死亡启动相关蛋白ALOX 5水平升高有关（图1h）。这些发现与一组与铁死亡相关基因的聚集表达增加相结合（图1i），共同揭示了与ALS中的铁死亡一致的分子特征（图1j）。
图1 ALS患者脊髓中的铁死亡标志物
2. 小胶质细胞在体外对铁死亡的敏感性更高
研究者使用一系列诱导剂和抑制剂在体外模拟了铁死亡（图2a），以确定哪些细胞可能受到影响。对脑中主要细胞类型的原代鼠培养物的分析显示，小胶质细胞对GPX4抑制剂RSL3比星形胶质细胞和神经元更敏感（图2b）。小胶质细胞对铁死亡诱导剂erastin（谷氨酸胱氨酸反向转运蛋白抑制剂）和丁硫氨酸磺酰亚胺（谷胱甘肽合成所需的γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶抑制剂）也明显敏感（图2c，d）。小胶质细胞中的RSL3毒性和脂质过氧化（通过荧光脂质过氧化传感器C11-BODIPY检测）被铁死亡抑制剂利司他汀-1和去铁酮阻止（图2e，f）。比较体外培养的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元发现，在ALS中显著升高的脂氧合酶基因（即ALOX5、ALOX5AP和ALOX15）在小胶质细胞中高度富集（图2g），并且在小胶质细胞而不是星形胶质细胞中响应RSL3处理而增加，这一作用被利司他汀-1减轻（图2h）。对铁死亡相关基因的主成分分析（PCA）显示，RSL3处理诱导的小胶质细胞变化与ALS影响的脊髓中明显的变化相似（图2i）。混合胶质细胞培养物的活细胞成像表明，与星形胶质细胞相比，在RSL3剂量较低时，小胶质细胞中发生脂质过氧化（图2j）。
图2 小胶质细胞对铁死亡的敏感性更高
3. 铁死亡应激诱导神经毒性胶质细胞活化
研究者发现将RSL3或erastin而不是LPS应用于混合神经胶质培养物，产生了具有神经毒性的条件培养基（图3a（i）），这表明当应用于胶质细胞时，这些典型的铁死亡诱导剂产生了相当的神经毒性结果。直接应用于神经元的等效处理没有神经元死亡，证实了神经胶质细胞在这种非细胞自主神经元死亡模型中的作用（图3a（v））。此外，通过用利司他汀-1处理神经胶质细胞来减轻RSL 3或erastin诱导的神经胶质条件培养基的神经毒性，支持神经胶质铁死亡应激作为起始事件的作用（图3a（i））。来自用铁死亡诱导剂或LPS处理的分离的星形胶质细胞或小胶质细胞的培养基对神经元没有毒性（图3a（ii，iii）），而小胶质细胞条件培养基对包含神经元和星形胶质细胞的培养物有毒性（图3a（iv））。这表明神经毒性级联反应是在小胶质细胞中启动的，但神经毒性的作用需要星形胶质细胞的参与。来自用亚毒性RSL3（InM）处理的小胶质细胞的培养基对含有神经元和星形胶质细胞的培养物是有毒的（图3a（iv）），这表明单独的小胶质细胞中的亚致死性铁死亡应激足以诱导神经毒性星形胶质细胞活化。此外，应用于混合神经胶质细胞培养物的铁死亡诱导剂能够上调小胶质细胞C1qa、Il1a和Tnf，以及与神经毒性神经胶质细胞相关的基因表达，并且这些标记物能够被铁死亡抑制剂livestatin-1和去铁酮抑制（图3b），而在用铁死亡诱导剂处理之前从混合的神经胶质培养物中分离星形胶质细胞则能够消除与神经毒性相关的基因的上调（图3c），这证实了由铁死亡应激引起的神经胶质的神经毒性活化需要小胶质细胞的存在。
图3 铁死亡应激诱导神经毒性胶质细胞活化
4.神经毒性胶质细胞活化标志物与ALS中的铁死亡相关
首先研究者发现ALS患者脊髓中补体成分3 （C3）蛋白升高（图4a），这与之前的报道一致。此外，转录组的表达变化与A1和A2星形胶质细胞的特征一致，并且鉴定为与神经毒性胶质细胞相关的基因子集，在ALS影响的脊髓中均升高（图4b, c）。相关性分析显示，在人ALS影响的脊髓中，与铁死亡相关的基因的表达与神经毒性胶质细胞活化相关的基因表达呈正相关（图4d）。
图4 胶质细胞活化和铁死亡的标志物在人类ALS影响的脊髓中相关
5.ALS模型小鼠重现了人类ALS受累组织中明显的铁死亡和神经毒性胶质细胞活化的迹象
研究者对从SOD1G37R小鼠ALS模型症状中期收集的脊髓组织进行分析，发现铁的积累，铁氧化酶活性的丧失，以及铁处理基因的表达改变（图5a-d）；同时，脂质过氧化也增加（图5e），GPX4蛋白减少（图5f）。在小鼠模型中，与铁死亡一致的基因表达特征也很明显（图5g, h）。神经毒性胶质细胞活化的分子标志物在SOD1G37R小鼠模型中也升高（图5i, j）。
图5 ALS模型小鼠重现了人类ALS受累组织中明显的铁死亡和神经毒性胶质细胞活化的迹象
6.CuII(atsm)防止神经胶质细胞铁死亡和神经毒性神经胶质细胞活化
细胞和血脑屏障渗透性小分子CuII(atsm)（图6a）在永生化细胞系、原代神经元和无细胞测定的单一培养物中表现出抗Fe毒性的生物学活性。研究者发现，在与livestatin-1和ferrostatin-1相似的浓度下，CuII(atsm)可防止混合神经胶质细胞培养物中RSL3诱导的脂质过氧化和细胞毒性（图6b）。此外，在分离的小胶质细胞中，CuII(atsm)能够减轻RSL3诱导的铁死亡相关基因的上调（图6c），以及与混合胶质细胞培养物中由亚致死RSL3或erastin诱导的神经毒性胶质细胞活化相关的基因表达（图6d）。同时，CuII(atsm)可抑制RSL3或erastin诱导的胶质细胞条件培养液的神经毒性（图6e）。
图6 CuII(atsm)防止神经胶质细胞铁死亡和神经毒性神经胶质细胞活化
7.铁死亡和神经毒性胶质细胞活化标志物的药理学缓解与体内疾病改善相关
为了进一步探究铁死亡和神经毒性胶质细胞活化之间的关系，研究者用CuII(atsm)处理一组SOD1G37R ALS模型小鼠，在疾病的体征发作后开始治疗（图7a），CuII(atsm)治疗减缓了运动功能的下降速度，并导致生存率的总体改善（图7b-d）。从175-195天的症状中期年龄的动物收集的脊髓组织的分析显示，CuII(atsm)治疗减轻了铁水平升高、铁氧化酶活性丧失、脂质过氧化升高和GPX 4蛋白降低（图7i, j）。与CuII(atsm)的抗铁死亡作用和体内诱导神经胶质活化的铁死亡一致，在SOD1G37R小鼠模型中，用CuII(atsm)按比例处理抑制了铁死亡和神经毒性神经胶质活化的分子特征（图7k）。
图7 铁死亡和神经毒性胶质细胞活化标志物的药理学缓解与体内疾病改善相关
7.实验范例和人类受疾病影响的组织在铁死亡和神经毒性胶质细胞活化的分子特征中的一致性
主成分分析（PCA）显示，在用RSL3处理的神经胶质细胞、散发的ALS影响的组织和SOD1G37R小鼠模型之间，与铁死亡或神经毒性神经胶质活化相关的基因表达的变化非常相似（图8a, b）。
图8 实验范例和人类受疾病影响的组织在铁死亡和神经毒性胶质细胞活化的分子特征中的一致性
文章小结
这篇文章可谓既是紧跟当前研究潮流，将国自然热点——“铁死亡”与神经免疫调控这一热点领域相结合；又凭借硬实力在一众研究中脱颖而出——将胶质-神经元共培养和条件培养基转移实验等新颖的研究方法，与患者来源大样本量测序数据相结合。强强联手，干湿结合，轻松拿下高分文章！看到这里，各位小伙伴们是不是已经跃跃欲试了？想要复现这篇文章的思路和方法，就赶紧扫码来联系小薇吧！
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