基因组工程是一种重要的技术，可以用于修改生物体的基因组。CRISPR-Cas9系统和腺相关病毒（AAV）修复模板的结合被广泛应用于基因组工程。然而，这项研究发现，在使用CRISPR-Cas9系统和AAV修复模板进行基因组工程时，经常会发生腺病毒载体的串联插入，即腺病毒载体在基因组中形成多个连续的插入片段。这种串联插入可能会影响基因组编辑的准确性和安全性，因此需要进一步研究和解决。这项题为“Genome engineering with Cas9 and AAV repair templates generates frequent concatemeric insertions of viral vector”的研究成果于2024年2月8日发表在《Nature》上。
（图片来源：nature）
关键词：
CRISPR-Cas9、AAV、基因编辑、串联插入、数字PCR
正文内容：
实验设计与方法
实验设计： 本研究旨在利用CRISPR-Cas9和腺相关病毒6型（A）进行基因编辑，以实现人类诱导多能干细胞（iPSCs）和造血干细胞（HSPCs）中的靶向基因敲入。本研究提出了一种创新方法，通过移除AAV的ITR（末端重复序列）来降低串联插入的发生率。此外，本研究还开发了三种数字PCR方法，用于检测复杂的基因型，包括串联插入。本研究还比较了不同编辑方法（无切割、内部切割、远端切割）对编辑效率和串联插入频率的影响。
（图片来源：nature）
方法： 细胞培养：本研究使用了人类诱导多能干细胞（iPSCs）、人类胚胎干细胞（ESCs）和人类CD34+造血干细胞进行实验。AAV载体生产：本研究利用含有A ITR的pAAV-MCS载体构建了A载体。电穿孔和转导：本研究使用Lonza Nucleofector系统进行电穿孔，将Cas9 RNP和A载体转导到细胞中。
实验步骤
本研究主要探讨了CRISPR-Cas9与A修复模板在基因组编辑过程中产生的串联插入病毒载体基因组问题。
1. 细胞培养与基因编辑：利用CRISPR-Cas9和A载体对人类多能干细胞（iPSCs）和造血干细胞（HSPCs）进行基因编辑，以实现靶向基因敲入。
2. 数字PCR检测：采用数字PCR（ddPCR）技术检测编辑细胞中的基因型，包括野生型、单等位基因敲入和双等位基因敲入。
3. Southern印迹分析：利用Southern印迹技术分析编辑细胞的DNA，以检测串联插入的病毒载体基因组。
4. 流式细胞术：采用流式细胞术分析编辑细胞中荧光标记的基因敲入效率和多分散性。
5. 克隆分析：从编辑细胞中分离出单克隆，并进行进一步的基因型分析。
6. 病毒载体ITR的去除：研究开发了两种方法来去除AAV载体基因组中的ITR区域，以防止串联插入的发生。
7. 小鼠移植实验：将编辑后的HSPCs移植到免疫缺陷小鼠中，以评估ITR去除方法对造血干细胞功能的影响。
8. 数据分析：对实验数据进行统计分析，以评估不同方法对基因编辑效率和串联插入频率的影响。
（图片来源：nature）
实验结果与分析
研究发现，在人类多能干细胞和造血干细胞中，当CRISPR-Cas9与A病毒载体联合使用时，约35%的基因编辑细胞出现了串联插入现象。串联插入主要是由AAV病毒载体基因组中的ITR区域连接形成的。研究团队成功开发了ddPCR方法，用于检测和表征串联插入。进一步实验表明，在转导后去除AAV病毒载体的ITR区域，可以显著降低串联插入的发生频率。
结论
在CRISPR-Cas9与A病毒载体联合使用进行基因编辑时，需特别关注串联插入问题。本研究提供的方法可用于检测和表征串联插入，并有助于减少其在基因编辑中的应用。通过优化基因编辑策略，可提高基因编辑的准确性和可靠性。
论文地址：http://www-nature-com-s.webvpn.zju.edu.cn:8001/articles/s41587-024-02171-w