帕金森病（PD）是一种进行性的神经退行性疾病，通常发生在老年人身上。它的主要特征是黑质致密部中多巴胺能神经元的丢失以及细胞内α-突触核蛋白聚集形成路易小体。患者会出现一系列运动症状，包括震颤、肢体僵硬、动作迟缓等。许多患者还会出现认知功能受损或痴呆。多巴胺替代疗法和脑深部电刺激可以缓解运动症状，但无法延缓神经变性。
鞘脂激活蛋白原（PSAP）是一种分泌型神经营养因子，也是一种溶酶体蛋白，作为四种鞘脂激活蛋白的前体。之前的研究发现，PSAP的变异与帕金森病有关。这种蛋白的运输是通过与颗粒蛋白前体（PGRN）形成异源二聚体而实现的。PGRN也是一种溶酶体蛋白，水解后产生颗粒蛋白，而PGRN单倍剂量不足会导致额颞叶痴呆。
瑞典卡罗林斯卡医学院和乌普萨拉大学的研究人员深入分析了PSAP和PGRN在帕金森病中的作用。研究者发现，PSAP可维持多巴胺能神经元的脂质稳态，并对抗实验性帕金森病。这项研究成果于2023年9月发表在《Nature Communications》杂志上。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员采集了帕金森病患者及对照的大脑黑质样本、脑脊液及血浆样本，委托赛业生物构建了PSAP条件性敲除小鼠，将其与Cre工具鼠配繁获得多巴胺能神经元中的PSAP基因缺失的cPSAPDAT小鼠。为了方便对比，研究者还构建了cPSAPSERT小鼠，其血清素神经元中的PSAP基因缺失。研究者对实验中的小鼠和大鼠进行了一系列行为测试，包括旷场实验、爬杆实验、阿扑吗啡诱导的旋转实验等。研究者利用高效液相色谱（HPLC）分析了多种神经递质的浓度，并采用高通量的MALDI-MSI方法，对小鼠大脑开展非靶向空间脂质组分析。
技术路线
01
比较帕金森病患者及对照的大脑、血浆和脑脊液中的PSAP水平
02
构建DA神经元中PSAP基因缺失的cPSAPDAT小鼠，评估多巴胺能标志物和小鼠行为
03
通过MALDI-MSI方法评估cPSAPDAT小鼠大脑中的脂质成分变化
04
通过多巴胺能标志物分析和小鼠行为测试，研究PSAP在α-syn毒性中的作用
05
评估通过AAV和封装细胞递送PSAP是否有治疗帕金森病的潜力
研究结果
1
帕金森病患者大脑、血浆和脑脊液中的PSAP水平发生变化
首先，研究人员比较了帕金森病患者和对照的黑质致密部（SNc）中多巴胺能神经元的PSAP和PGRN水平。免疫荧光染色结果显示，PSAP与PGRN共定位。重要的是，与对照组相比，帕金森病患者的多巴胺能神经元（酪氨酸羟化酶TH阳性）中的PSAP减少，而PGRN不变。之后，研究者又比较了患者和对照的脑脊液和血浆中的循环PSAP和PGRN水平。研究者发现，脑脊液和血浆PSAP均与帕金森病的运动症状相关，而PGRN与非运动症状相关。
2
cPSAPDAT小鼠表现出多巴胺能标志物的减少和行为缺陷
为了研究PSAP在多巴胺能系统中的作用，研究人员委托赛业生物构建了PSAP条件性敲除小鼠，将其与Cre工具鼠配繁获得cPSAPDAT小鼠，能够特异性诱导多巴胺能神经元中PSAP基因的缺失。通过高效液相色谱分析，研究者发现老龄cPSAPDAT小鼠纹状体、伏隔核和海马体中的多巴胺能神经递质明显减少，包括多巴胺、高香草酸和3-甲氧基酪胺（图1）。
为了进行对比研究，研究人员还构建了另一种小鼠品系cPSAPSERT，其血清素神经元中的PSAP基因缺失。与cPSAPDAT小鼠不同，cPSAPSERT小鼠海马体中的5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸未检测到变化（图1）。对cPSAPDAT小鼠进行行为评估后，研究者发现8月龄和16月龄小鼠出现运动减退现象，4月龄小鼠和16月龄小鼠的姿势控制和精细运动受损。同时，cPSAPDAT小鼠还表现出焦虑和抑郁样症状。相比之下，cPSAPSERT小鼠在行为测试中并未表现出异常。
3
cPSAPDAT小鼠大脑中的脂质成分出现显著差异
PSAP在溶酶体中被裂解为鞘脂激活蛋白（A-D），这些蛋白进一步调节与溶酶体鞘脂相关的水解酶。考虑到鞘脂激活蛋白在许多糖鞘脂的代谢中起着重要作用，研究人员采用高通量的双极性MALDI-MSI方法，对cPSAPDAT和对照小鼠的大脑开展非靶向空间脂质组分析。结果显示，4月龄、8月龄和16月龄cPSAPDAT小鼠和对照小鼠大脑中的脂质成分存在显著差异（图2）。
具体来说，在16月龄cPSAPDAT小鼠的大脑中，高度不饱和心磷脂（CL）增加，低度不饱和CL减少；长链CL增加，短链CL减少。磷脂酰胆碱（PC）也出现类似的变化模式。第一种模式表明脂肪酸的去饱和化作用过强，而第二种模式则表明过氧化物酶体β-氧化作用过强。此外，研究者还发现，cPSAPDAT小鼠大脑中的鞘脂类普遍减少，比如棕榈酸肉碱和鞘磷脂类。相比之下，cPSAPSERT小鼠大脑中的脂质成分与对照组相比没有几乎没有差异（图2）。这些结果表明，PSAP可维持多巴胺能神经元的脂质稳态。
4
cPSAPDAT小鼠对α-syn诱导的多巴胺能变性更敏感
越来越多的数据表明，脂类对α-突触核蛋白（α-syn）的聚集和神经毒性及路易小体的形成起着至关重要的作用。最近有报道称，不饱和脂肪酸会增加α-syn的毒性。为此，研究人员分析了PSAP在α-syn毒性中的作用。研究者在4月龄cPSAPDAT小鼠和野生型对照小鼠的单侧黑质内注射AAV-α-syn或AAV-GFP，部分小鼠同时注射AAV-PSAP。旋转测试表明，当α-syn过表达时，cPSAPDAT小鼠的旋转次数比WT小鼠多。不过，通过注射AAV-PSAP来补充PASP可以防止AAV-α-syn对cPSAPDAT小鼠旋转行为的恶化作用。
免疫组化分析结果表明，在两种小鼠中，α-syn过表达都会降低同侧纹状体中的酪氨酸羟化酶，不过它在cPSAPDAT小鼠中造成的纹状体和黑质酪氨酸羟化酶丢失比WT小鼠明显得多，表明cPSAPDAT小鼠对α-syn诱导的多巴胺能变性更敏感。与行为学数据一致的是，PSAP的过表达显著恢复了纹状体和黑质的酪氨酸羟化酶。磷酸化的α-syn Ser129（p-Ser129 α-syn）被认为是α-syn的病理形式，容易聚集。研究人员发现，在cPSAPDAT小鼠中，α-syn过表达会导致p-Ser129 α-syn显著聚集，而PSAP的过表达可逆转这种现象。
5
PSAP的生物递送可防止α-syn诱导的大鼠多巴胺能神经元丢失
此外，研究人员还分析了通过AAV过表达PSAP是否能保护多巴胺能神经元免受6-OHDA诱导的氧化应激。在6-OHDA诱导纹状体病变前六周，研究者在WT小鼠同侧黑质致密部内注射AAV-PSAP或AAV-GFP。注射AAV-PSAP的小鼠向对侧旋转的次数明显少于对照小鼠，表明PSAP的过表达保护了纹状体多巴胺能神经元免受6-OHDA损伤。
考虑到PSAP和PGRN都是分泌蛋白，可被cPSAPDAT小鼠的多巴胺能神经元所吸收，故研究人员考虑采用封装细胞（ECB）来递送PSAP，以此来抵消α-syn诱导的毒性。研究者将PSAP单侧递送至同侧半球已注射AAV-α-syn的大鼠的纹状体（图3）。研究者在2周、8周和12周开展旷场实验，并在12周进行旋转测序，以评估大鼠的运动行为。
旷场实验结果表明，不使用封装细胞递送装置的大鼠会出现α-syn诱导的进行性运动减退，而递送了PSAP或PSAP-PGRN的大鼠则表现出完整的运动能力。在旋转测试中，ECB-PSAP大鼠向对侧旋转的次数明显少于无装置大鼠和ECB-PGRN大鼠，这进一步证明了PSAP对α-syn诱导的运动失调具有保护作用。
研究结论
总的来说，这项研究表明，PSAP在多巴胺能神经元的生理稳态中发挥作用，尤其是在脂质代谢中。多巴胺能神经元中PSAP的缺失会增加小鼠对α-syn过表达的脆弱性。值得注意的是，黑质内注射AAV-PSAP可挽救α-syn诱导的帕金森病。此外，采用封装细胞向纹状体内递送PSAP也能够治疗α-syn诱导的帕金森病。因此，PSAP是帕金森病发病机制的一种潜在调节因子，补充PSAP可能有助于阻止帕金森病进展。
原文检索：
[1]He, Y., Kaya, I., Shariatgorji, R. et al. Prosaposin maintains lipid homeostasis in dopamine neurons and counteracts experimental parkinsonism in rodents. Nat Commun 14, 5804 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41539-5