今天给同学们分享一篇实验文章“Molecular signatures of long-term hepatocellular carcinoma risk in nonalcoholic fatty liver disease”，这篇文章发表在Sci Transl Med期刊上，影响因子为17.1。
结果解读：
研究设计
研究设计和患者人口统计数据总结如图1和表1所示。由于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中原发性肝细胞癌（HCC）的发病率较低（每年<1%）（6, 7），因此要可靠地确定与HCC发展时间相关的分子特征并具有足够的统计力量是具有挑战性的（图S1A）。作者之前在开发无因果关系的PLS时解决了这个挑战，通过以下两个假设来定义具有先前HCC病史患者的生物标志物。首先，他们的肝脏已经成为后续和多中心癌变的土壤，其发病率约为HCC原发患者的三倍。其次，这些患者的HCC发病率（临床上被认为是HCC复发）很可能是新发的HCC复发，即与先前治疗的肿瘤克隆独立的后续复发，正如作者之前的杂合性缺失分析所示（15）。随后，PLS在原发性HCC患者和慢性肝病患者的独立队列中成功验证（9-11）。在这里，作者采用了相同的策略来识别和验证NAFLD特异性HCC风险标志（PLS-NAFLD）。作者首先在48名先前患有HCC病史的患者队列中（推导集）定义了该标志，以便预测新发HCC复发（图S1B）。随后，在独立的外部队列中对106名NAFLD患者（组织验证集1）和59名先前接受过根治性手术肿瘤切除的NAFLD患者（组织验证集2）进行了标志的验证。此外，作者使用计算算法TexSEC（12）将PLS-NAFLD转化为血清蛋白组合物PLSec-NAFLD，并在独立队列中对59名患有NAFLD和肝硬化的HCC-naïve患者（血清验证集）进行了外部验证。作者的目标是确认NAFLD特异性HCC风险生物标志物能够实现HR > 2的风险分层，从而实现经济高效的HCC筛查，并确认作者的病因不可知HCC风险生物标志物PLS/PLSec能够改善预后预测。预后相关性研究表明，病因不明的PLS在推导和组织验证集中的关联性有限，支持探索NAFLD特异性生物标志物以改进风险预测（图S1C-E）。
组织基础NAFLD HCC风险标志的推导，PLS-NAFLD
在推导集中，作者定义了一个由80个高风险基因和53个低风险基因组成的133基因PLS-NAFLD（图S2A，表S1），将19名（40%），9名（18%）和20名（42%）患者分为高风险、中等风险和低风险组。值得注意的是，高风险和中等风险组的HCC发病率相似（图S2B），这表明该标志的主要用途是区分低风险HCC发展的患者。事实上，低风险组（7.2%）的（假定为间歇性）HCC复发年发病率明显低于其他组（60.4%）。因此，为了后续验证，作者将高风险和中等风险组合并为高风险组，与低风险组进行比较（图2A，B）。PLS-NAFLD与任何临床、组织学或NAFLD相关的遗传特征独立，包括纤维化阶段和单核苷酸多态性（图S2C-E），支持PLS-NAFLD在这些临床可用变量之外提供了补充的预后信息。高风险PLS-NAFLD在各种多变量模型中均显示出强有力的预后关联，调整了潜在混杂变量（表S2，3）。以前报道的任何基因表达特征对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的长期肝细胞癌（HCC）风险没有预测能力（表S2）。在其他病因（如丙型肝炎、乙型肝炎或与酒精相关的肝病）患者中，PLS-NAFLD没有明显的预后相关性（图S2F，G），支持该特征与NAFLD的特异性（8，16，17）。
在肝细胞中编码的PLS-NAFLD中的分子失调
分子途径分析显示，高风险的PLS-NAFLD模式与T细胞介导的免疫反应、B细胞活化、巨噬细胞迁移以及T细胞耗竭有关（图S2H，表S4）。高风险的PLS-NAFLD还与先前报道的与NAFLD驱动的疾病进展和肝癌发生相关的途径有关，包括肿瘤坏死因子（TNF）途径（18）、自噬和YAP信号传导（19）以及破坏的昼夜节律（20）。在高风险的PLS-NAFLD患者中观察到STAT3的激活，而未观察到STAT1的激活，与先前观察结果一致（21）。相反，与高风险的PLS-NAFLD相关的代谢途径调节因子，特别是胆汁酸代谢，如成纤维细胞生长因子（FGF）19（18）和FGF21（22）以及核受体信号传导，例如法尼酰X受体（FXR）途径，呈下调状态。一个FXR激动剂obeticholic acid的转录靶基因签名也被抑制，这表明高风险的PLS-NAFLD预测患者可能是obeticholic acid治疗的候选人。尽管与组织炎症分级没有预测相关性（表S2），PLS-NAFLD编码了多样的炎症途径。这突显了对炎症的粗略组织学评估（淋巴细胞浸润的半定量评分）的局限性，以及在预测长达11年的HCC风险时，表征免疫细胞亚群及其功能状态的重要性。
根据对四个人类肝脏单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集（共计108,855个细胞）的荟萃分析，作者接下来确定了高风险PLS-NAFLD的细胞来源，这些数据集代表了健康到NAFLD受影响的肝硬化肝脏中预期存在的所有主要细胞类型（表S5）（24-28）。作者根据转录组模式的相似性确定了31个单细胞聚类（SC01到SC31）（图2C，图S3A，表S6）。如预期，均匀流形近似和投影（UMAP）图显示细胞按细胞类型而不是数据集进行聚类（图2C，图S3B）。在肝细胞聚类中，作者确认了与NAFLD相关的细胞类型，如CXCR6+PD-1+ CD8 T细胞（29）和TLR4+库普弗细胞（图S3C）（30），其中一些与PLS-NAFLD的高风险模式相关。
由平均相对表达量的特征基因（31个）定义的高风险PLS-NAFLD评分主要与免疫细胞亚型相关，而低风险评分主要与内皮细胞亚型相关（图2D）。在单核吞噬细胞（MP）亚型内，高风险和低风险评分富集于不同的亚亚型（例如，高风险基因在SC29亚型中，低风险基因在SC10亚型中）（图2D，图S3D）。作者发现，与高风险相关的SC29亚型包含与NAFLD进展有关的XCR1类型1传统DCs，但尚未与HCC风险相关（图S3E，F）（32）。相反，与低风险相关的SC10亚型包含骨髓源性单核细胞（BMDCs），它们位于肝硬化中向成熟巨噬细胞或DCs分化的分叉点上（25）。这些结果表明，这些细胞类型的互斥存在有助于在NAFLD中形成易患HCC的肝微环境。
在所有细胞类型亚型中，作者发现SC29中的细胞几乎完全表达IDO1，即编码吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的基因（图S3G）。IDO1是一种限速酶，它将L-色氨酸转化为L-酪氨酸，通过诱导耐受性传统型树突状细胞和T细胞耐受性，抑制抗肿瘤免疫（33）。事实上，SC29特征的富集与基于PLS-NAFLD的风险预测显著相关（rho=0.44；p=0.002）（图2A），这表明IDO1可能是调节高风险PLS-NAFLD并降低NAFLD中HCC发生率的治疗靶点。
作者接下来使用全基因组空间转录组分析将PLS-NAFLD在人类NAFLD受影响的肝脏（F阶段2；NAFLD活动评分5）中进行空间映射到组织结构上（图S4A）。首先，作者根据组织学确定的门脉区域和中央静脉以及计算确定的与这两种组织结构的接近程度（图2E，图S4B，C），确定了门脉小叶、门脉周围、中央小叶和中央周围区域（根据实验中称为“斑点”的网格状区域）。具有升高的高风险PLS-NAFLD评分的斑点主要观察到在门脉小叶中，而升高的低风险评分分布在四种类型的区域/斑点中（图2F）。
门户区高风险评分与SC29（IDO1+ cDCs）、SC03（疲劳CD8+ T细胞）、SC19（记忆B细胞）、SC20（间质细胞）和SC24（浆细胞）的存在相关，而在周围中央和中叶区域的低风险评分与SC30（ECs）和SC10（BMDMs）相关，基于非负矩阵分解的细胞类型解卷积（图2G）（34）。五种高风险-PLS-NAFLD相关细胞类型及其共定位最常见于门户区（图S4D，E）。在这五种细胞类型中，SC29（IDO+ cDCs）和SC03（疲劳CD8+ T细胞）之间的细胞间相互作用突出（图2H，图S4F）（35）。IDO1+ cDCs和PD-1+ CD8+ T细胞确实在门户区与升高的高风险PLS-NAFLD评分密切接触（图2I）。
对NAFLD患者进行PLS-NAFLD的独立验证，这些患者在HCC前是NAFLD患者
作者在一个独立的NAFLD患者队列中对PLS-NAFLD进行了外部验证，该队列包括106例未患HCC的NAFLD患者（组织验证集1）（图3A，表1）。在中位随访时间为8.9年（四分位数范围[IQR]，5.1-11.9年）期间，有6名患者发展为HCC（年发病率为0.6%）。该特征将71名患者（67%）和35名患者（33%）分为高风险组和低风险组（图3B）。年龄与高风险PLS-NAFLD之间没有关联（p=0.14）。高风险组的HCC年发病率分别为0.9%和0%，15年患病概率分别为22.7%（95%置信区间[CI]，3.6%-38.0%）和0%（95% CI，0%-0%）（图3C）。高风险PLS-NAFLD与HCC发生独立相关（经Firth校正的调整风险比[aHR]（36），260.0；95% CI，1.02-Inf）（表S3）。值得注意的是，三例HCC病例发生在纤维化程度较轻（F分期为1）的患者中，这类患者通常被排除在推荐的定期HCC筛查之外，但PLS-NAFLD将其识别为高风险。
通过重复的PLS-NAFLD测量，对HCC风险进行了精细化预测
临床生物标志物，如甲胎蛋白（AFP），往往会随时间波动，与单个横断面测量相比，它们随时间序列测量的变化更能提供更好的预后信息（37）。作者假设重复测量PLS-NAFLD可能会改善HCC风险预测，在组织验证集1中使用随访肝活检进行了测试。鉴于低风险组中没有发生HCC事件，作者对71名高风险患者中的58名进行了剖析，他们进行了第二次活检，中位间隔为2.3年（IQR，1.8-3.0年）。作者使用组合富集分数（CES）（11）来量化连续活检之间基于PLS-NAFLD的调节性预后风险。有27名（47％）患者的HCC风险降低，22名（38％）患者的风险稳定，9名（16％）患者的PLS-NAFLD相关发展HCC风险更高（图3D）。所有HCC都发生在PLS-NAFLD风险没有改善的患者身上。PLS-NAFLD风险的变化与HCC发展显著相关（aHR with Firth’s校正（36），15.5；95％CI，1.25-2273），并且显示出稳定的高判别能力（图3E，F）。年发病率为2。2%和0%分别是PLS-NAFLD非改善患者和改善患者的发生率。非改善患者的发生率高于传统使用的1.5%的截断值，以证明HCC筛查的成本效益（3）。CES与纤维化阶段的变化显著相关（rho=0.41；虚假发现率[FDR]=0.028）（图3D）。CES还显示出比纤维化阶段的变化更好的预测能力（图3F，表S7）。总的来说，对PLS-NAFLD进行重复评估将改进NAFLD中的HCC风险估计。
独立验证PLS-NAFLD在具有先前HCC病史的临床NAFLD中的有效性
作者进一步在59例经历了完全肿瘤切除且没有放射学/病理学残留肿瘤的NAFLD患者中进行了PLS-NAFLD的外部验证（组织验证集2）。PLS-NAFLD将34例（58%）和25例（42%）患者分为高风险组和低风险组。高风险预测与HCC在根治性切除后的复发有关（aHR，2.38；95% CI，1.07-5.25）（图3G，H，表S3）。高风险患者的HCC发生率分别为1年时的34.0%和13.8%，5年时的71.8%和42.9%。
PLS-NAFLD（PLSec-NAFLD）的血清蛋白基代用标志物
肝组织需求将成为组织基础的PLS-NAFLD广泛应用的主要瓶颈，特别是对于未接受肝脏手术的HCC-原发性肝癌患者而言。为了解决这个限制，作者利用之前开发的计算流程TexSEC（www.texsec-app.org）将基于组织转录组的PLS-NAFLD转化为基于血液的四蛋白质分泌组（PLSec-NAFLD）（12）（图S5A）。PLSec-NAFLD由2种高风险蛋白质（淋巴激动素和前降钙素，分别由XCL1和GRN编码）和2种低风险蛋白质（血管生成素2和肝细胞生长因子受体，分别由ANGPT2和MET编码）组成。淋巴激动素是XCR1的配体，表明该组可以监测肝脏中XCR1 cDCs的状态（38）。PLSec-NAFLD已在美国食品和药物管理局（FDA）批准的多重临床诊断平台xMAP assay（Luminex）上实施，并在两个独立的优化集（n=73和n=72）中定义了>1的截断值，用于预测NAFLD的高风险（图S5B）。
PLSec-NAFLD随后在一个独立的NAFLD肝硬化患者队列中进行了外部验证（血清验证集），共有59名HCC-naïve患者。PLSec-NAFLD鉴定出42名（71%）高风险患者和17名（29%）低风险患者（图4A）。与基于组织的PLS-NAFLD类似，基于PLSec-NAFLD的预测与已知的HCC风险相关临床变量无关。高风险患者的年HCC发生率为2.7%，低风险患者为0%，15年概率分别为37.6%和0%（图4B）。高风险预测与HCC发展显著相关（经Firth校正的aHR（36），32.4；95% CI，1.13-1.96×10 10 ），并且PLSec-NALFD随时间变化的校准良好（图4C，表S3）。值得注意的是，所有HCC都发生在高风险患者中，支持该生物标志物可以区分低风险患者，因为他们的HCC风险微乎其微，所以可以免除常规的HCC筛查。
治疗调节PLS-NAFLD作为未来HCC发生的替代生物标志物
各种非酒精性脂肪肝（NAFLD）治疗方法已经积极探索，针对脂肪变性、炎症和纤维化等特定病理过程（39）。然而，在临床试验的典型时间范围内，很难估计它们的短期治疗调节对长期预后的影响（15, 40）。为了解决这个挑战，作者评估了PLS-NAFLD作为HCC发展的替代生物标志物的实用性。作为概念验证，作者评估了PLS-NAFLD调节的程度及其与未来HCC风险的关联，针对以下三种不同类型的治疗干预措施中的NAFLD患者。
第一个例子是肥胖手术，与NAFLD患者的HCC发病率降低有关（41）。作者分析了79名NAFLD患者治疗前后获取的肝活检样本的肝转录组谱（图5A）（42, 43）。根据治疗前的肝转录组谱，68名（86%）患者被分为高风险组，11名（14%）患者被分为低风险组。在高风险患者中，与仅进行生活方式干预相比，肥胖手术显示出更频繁地显著降低基于PLS-NAFLD的HCC风险（比值比[OR]，0.21；95% CI，0.06-0.73），这与以前的流行病学研究中肥胖手术降低HCC发病率的幅度相当（HR，0.32）（41），而没有低风险患者显示出改善的PLS-NAFLD状态（图5B）。第二个例子是使用脂溶性他汀类药物，如阿托伐他汀和辛伐他汀，与NAFLD患者队列中HCC发病率降低有关（HR 0.36）（44）。与非他汀类药物使用者相比，脂溶性他汀类药物使用者的高风险PLS-NAFLD患病率降低了三倍（条件比值比，0.33；95% CI，0.16-0.68）在严重肥胖患者中，这与HCC发病率降低的幅度相当（图5C、D）（45）。第三个例子是使用IDO1抑制剂，可能针对作者在单细胞和空间转录组学中鉴定出的IDO1+ cDCs。在作者的PLS诱导细胞培养模型（cPLS系统）中（46），作者证实了临床开发用于恶性肿瘤的IDO1抑制剂epacadostat以剂量依赖的方式逆转了由游离脂肪酸治疗引起的高风险PLS-NAFLD模式（图5E、F）。
总结
总之，作者开发并验证了基于组织转录组和血清分泌组的签名，即PLS/PLSec-NAFLD，用于预测NAFLD患者的长期HCC风险并估计治疗干预的效果。这些签名可能有助于改善与NAFLD相关的HCC的不良预后。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎咨询！