各位看官久等了，今天小薇带来一篇Science的最新研究。肠道菌群已成为近几年研究热点，但随着研究深入，对肠道菌群的研究要求越来越高。脂质代谢作为新晋小生早已闯入研究者视野，引领另一轮研究热潮。那国自然热点常客肠道菌群携手新晋热点脂质代谢会碰撞出怎样的火花呢？长链非编码RNA在二者的关系中又是扮演着怎样的角色呢？以往，这些具体机制我们都知之甚少。而在本研究中，作者通过全转录组测序、基因敲除、CRISPR-Cas9、转基因小鼠、类器官等手段，利用体内、体外实验相结合的方式，层层剖析肠道菌群与长链非编码RNA及脂质代谢的神秘联系。作者大胆假设、小心论证、逻辑清晰、思路流畅，是一篇值得学习的文章。接下来，让小薇带你一起探索这篇文章研究内容及思路吧！
文献详情：
题目：肠道微生物群通过长链非编码RNA Snhg9重组肠道脂质代谢
杂志：Science
影响因子：IF=56.9
发表时间：2023年8月
研究背景
肠道菌群对哺乳动物的代谢有重要影响。鉴于代谢性疾病在世界范围内的流行率迅速增加，迫切需要了解肠道微生物群影响宿主代谢的机制。长链非编码RNA（lncRNAs）是一种不被翻译但仍具有生物学功能的RNA转录本。lncRNAs调节生物过程，如细胞增殖、细胞死亡、肿瘤发生和免疫等，但目前对它们参与肠道微生物群对宿主代谢的调节知之甚少。
研究思路
首先作者对常规培养和无菌小鼠的小肠上皮细胞进行全转录组测序，并通过定量聚合酶链反应（qPCR）证实，在微生物群的存在下，小肠上皮细胞中Snhg9的表达减少。接着通过质谱鉴定出CCAR2，并进一步通过免疫印迹检测。通过沉降实验作者发现CCAR2直接与Snhg9 RNA结合。作者通过过表达Snhg9的HEK-293T细胞中发现CCAR2与SIRT1的结合消除。接着作者使用稳定表达Snhg9的3T3-L1细胞，通过CRISPR-Cas9基因组编辑使3T3-L1细胞（Snhg9−/−细胞）中的Snhg9失活，发现lncRNA Snhg9通过解离CCAR2-SIRT1复合物来抑制Pparg的表达和脂质代谢。进一步，作者使用Villin-Snhg9转基因小鼠，通过RNA-seq分析Snhg9过表达是否影响体内脂质代谢。作者进一步使用抗生素处理小鼠评估了Snhg9调控的脂质代谢中对微生物群的需求。并通过Snhg9−/−小鼠验证。最后，作者使用MyD88−/−小鼠、Cd11c+细胞消耗的小鼠模型以及Rag1−/−小鼠发现微生物群通过髓系细胞-ILC3信号抑制Snhg9的表达。
主要结果
1、IncRNA Snhg9的表达被微生物群所抑制
作者首先对常规小鼠和无菌小鼠的小肠上皮细胞进行全转录组测序（RNA-seq），发现与无菌小鼠相比，由Snhg9（核仁小分子RNA宿主基因9）编码的lncRNA在常规小鼠的上皮细胞中的丰度减少（图1B）。作者通过qPCR证实[A1]，与无菌和抗生素处理小鼠的上皮细胞相比，来自常规小鼠的上皮细胞表达的Snhg9 RNA更少（图1C）。因此，在微生物群的存在下，小肠上皮细胞中Snhg9的表达减少。
2、lncRNA Snhg9与CCAR2结合
作者接着阐明Snhg9的生物学功能。通过质谱鉴定出最丰富的相互作用蛋白为细胞周期和凋亡蛋白2（CCAR2）（图2A和B）。免疫印迹检测Snhg9沉淀蛋白中的CCAR2（图2C）。进一步作者用体外转录的Snhg9和重组的CCAR2进行了沉降实验，发现重组CCAR2是由Snhg9 RNA沉淀的（图2D），这表明CCAR2直接与Snhg9 RNA结合。此外，Snhg9的突变影响了与CCAR2的结合。这些数据支持直接结合作用，表明Snhg9是一种直接与CCAR2结合的蛋白结合lncRNA。
3、lncRNA Snhg9将CCAR2与PPARγ抑制剂SIRT1分离，抑制PPARγ活性
接下来，作者研究了lncRNA Snhg9与CCAR2结合的细胞和生理结果。CCAR2是去乙酰化酶sirtuin 1（SIRT1）的内源性抑制剂。SIRT1通过与转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）相互作用来调节脂质代谢。SIRT1通过两种机制抑制PPARγ活性——通过去乙酰化PPARγ或与核受体辅抑制因子1（NcoR1）对接。这两种机制都降低了Pparg的表达，降低了脂质代谢。实验表明在HEK-293T细胞中过表达Snhg9在很大程度上消除了CCAR2与SIRT1的结合（图3A和B），并增加了SIRT1去乙酰化酶活性（图3C）和与NcoR1的结合（图3D和E）。这些数据表明，Snhg9通过隔离抑制蛋白CCAR2来促进SIRT1的活性。进而作者使用稳定表达Snhg9的3T3-L1细胞，通过RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实了Snhg9与CCAR2的结合。Snhg9的稳定表达抑制了Pparg及其蛋白产物PPARγ的表达，而CCAR2的共表达则挽救了Pparg和PPARγ的表达（图3F和G）。同样，Snhg9在小鼠小肠类器官中也有此表现。综上所述，Snhg9通过与CCAR2结合来抑制PPARγ的表达。通过CRISPR-Cas9基因组编辑使3T3-L1细胞（Snhg9−/−细胞）中的Snhg9失活，可增加Pparg、PPARγ和下游靶基因的表达(图3H、I)。过表达Snhg9抑制了3T3-L1细胞向脂肪细胞的分化（图3、J和K）。相反，Snhg9−/−3T3-L1细胞保持了分化和形成脂滴的能力（图3、L和M）。综上所述，研究结果显示，lncRNA Snhg9通过解离CCAR2-SIRT1复合物来抑制Pparg的表达和脂质代谢。
4、Villin-Snhg9转基因小鼠的脂质吸收减少，可以免受高脂饮食诱导的代谢紊乱的影响
作者使用Villin启动子强制Snhg9在常规小鼠（Villin-Snhg9转基因小鼠）的肠上皮细胞中表达Snhg9。与细胞研究结果一致，传统Villin-Snhg9转基因小鼠的肠上皮细胞中SIRT1去乙酰化酶活性比野生型同窝小鼠更高（图4A）。作者使用RNA-seq比较了Villin-Snhg9转基因小鼠与野生型同窝小鼠的小肠转录组来分析Snhg9过表达是否影响体内脂质代谢。KEGG通路分析证实，Snhg9过表达抑制了代谢通路相关基因的表达，包括PPAR信号通路（图4B）。Villin-Snhg9转基因小鼠不仅Pparg表达降低，而且参与脂肪酸吸收（如Cd36）、转运（如Fabp4）和合成（如Scd1）的基因也表达降低（图4C）。因此，Villin-Snhg9转基因小鼠与无菌小鼠相似，与野生型小鼠相比，其肠上皮细胞中脂质较少，而粪便中脂质较多（图4D-F）。高脂肪饮食10周后，Villin-Snhg9转基因小鼠的体重都有所下降，全身脂肪百分比较低（图4G），肝脏脂肪变性较轻（图4I），血清甘油三酯和游离脂肪酸也较低，糖耐量增加，胰岛素抵抗降低（图4J和K）。作者进一步评估了Snhg9调控的脂质代谢中对微生物群的需求。当抗生素处理耗尽微生物群时，喂食高脂肪饮食的野生型小鼠的体脂百分比降低了，与Villin-Snhg9转基因同窝小鼠相似（图4L）。为了进行比较，作者通过CRISPR-cas9介导的基因靶向技术生成了Snhg9−/−小鼠，当喂食高脂饮食时，他们的体脂百分比和体重增加都增加了(图4M)。这些数据支持了微生物群部分通过抑制肠道Snhg9的表达来促进体脂积累的结论。
5、微生物群通过髓系细胞-ILC3来抑制Snhg9的表达
细菌通过toll样受体（TLRs）及其共同的信号适配器MyD88激活肠上皮细胞的基因表达。与野生型对照相比，MyD88−/−小鼠肠道中Snhg9的表达增加（图5A），这表明MyD88是微生物抑制肠道中Snhg9表达所必需的。此外，Cd11c+细胞有抑制Snhg9表达的作用。使用Cd11c+细胞消耗的小鼠模型测试了这一想法，其中白喉毒素受体（DTR）由Cd11c启动子表达。与对照组相比，用白喉毒素选择性消耗Cd11c+细胞增加了Snhg9的表达（图5D）。因为Cd11c标记着髓系细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞，这些结果表明髓系细胞是微生物抑制肠道Snhg9表达所必需的。细菌通过一个免疫细胞信号传递来调节几个关键的肠上皮细胞基因的表达，主要涉及骨髓细胞和第三组先天淋巴样细胞（ILC3s）的表达。与野生型小鼠相比，缺乏T细胞和B细胞的Rag1−/−小鼠肠道内Snhg9的表达降低（图5E）。这表明T细胞和B细胞对于微生物抑制Snhg9是不可或缺的，而Snhg9表达的降低可能是Rag1−/−小鼠肠道内细菌负荷增加的结果。相比之下，用CD90.2抗体在Rag1−/−小鼠中消耗ILCs提高了Snhg9的表达（图5F），这表明微生物抑制Snhg9的表达需要ILCs。因此，微生物群通过髓系细胞-ILC3信号抑制Snhg9的表达。
文章小结
作者通过全转录组和质谱结合分析，发现lncRNA Snhg9通过解离CCAR2-SIRT1复合物来抑制Pparg的表达和脂质代谢，这一过程与肠道菌群密不可分。这些发现促进了我们对复杂的上皮细胞网络与肠道菌群之间的关系的理解。这些结果可能为靶向Snhg9和微生物群治疗代谢性疾病提供策略。该文章整体逻辑清晰、环环相扣！感兴趣的小伙伴们快来看看吧！