今天给同学们分享一篇实验文章“Single-cell analyses implicate ascites in remodeling the ecosystems of primary and metastatic tumors in ovarian cancer”，这篇文章发表在Nat Cancer期刊上，影响因子为22.7。
结果解读：
高分辨率的OC多地点单细胞转录组测序景观
为了阐明卵巢癌细胞组成的复杂性，作者利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析了14例晚期卵巢癌患者的未排序细胞，包括外周血(PB)、淋巴结(PLN)、原发肿瘤(Pri.OT)、配对的转移灶(Met.Ome)和恶性腹水(Fig. (Fig.1a1a和附表1)。这些患者表现出五种不同的组织学亚型和对铂类化疗的不同反应。总共，作者将223,363个高质量的单细胞分为五个主要的细胞系谱，通过经典标记物表达进行注释。
作者首先通过计算观察到的细胞数量与预期细胞数量的比值（R o/e ）来量化主要细胞群的相对组织富集情况，使用了HGSOC患者的数据（图1d、e）。正如预期的那样，B细胞和CD4 + T细胞在PLN中占主导地位，而淋巴细胞和单核细胞构成了PB样本的主要细胞组分。值得注意的是，作者在Pri.OT和Met.Ome中都发现了所有五个主要细胞系，并且大多数细胞类型的富集模式在这两个部位之间没有显著差异，这表明了一个类似的复杂TME对于原发性和转移性肿瘤细胞的发展是必要的（图1e）。腹水经常在晚期OC患者中发现，并与化疗反应相关，其中包含大量的免疫细胞和基质细胞。其中，CD8 + T细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是腹水的主要组成部分，细胞比例较高，表明存在炎症微环境。间皮细胞最近被报道与OC的转移密切相关，也优先在恶性腹水中发现（图1d，e）。
与非恶性细胞不同，根据推断的拷贝数变异（inferCNV）定义，肿瘤细胞表现出强烈的患者间异质性。值得注意的是，所有腹水样本中都检测到肿瘤细胞，平均比例为2.7%（53,499个中的1,444个）。作者的观察结果与卵巢癌肿瘤细胞更倾向于通过腹腔而不是通过血管扩散的观点一致，这凸显了腹水与腹腔内卵巢癌转移之间的密切关联。此外，inferCNV分析显示，在Met.Ome中发现的肿瘤细胞亚克隆也可在Pri.OT中检测到，表明这些亚克隆是腹腔转移的肿瘤发生群体。
OC中T细胞的动态关系
鉴于HGSOC是最常见的OC亚型，作者在随后的TME特定细胞区域的分析中重点关注HGSOC。作者首先关注OC中T细胞群体的内在特性和潜在功能。通过无监督聚类，作者确定了五个CD4亚型、五个CD8亚型和两个非传统亚型（图2a）。传统的T细胞亚型进一步分为天然（T2）、中央记忆（T3）、效应记忆（T4）、效应（T5）、调节（T6）、T辅助1（T7）-类似和耗竭（T10）T细胞亚型，显示出不同的组织偏好模式（图2a、b）。T细胞（T01和T06）富集于PB和PLN，保持静止状态。与先前的研究一致，大多数免疫抑制性FOXP3 T细胞（T03）和HAVCR2耗竭CD8细胞（T10）主要富集于这两个肿瘤部位（图12） 流式细胞术的分析还表明，肿瘤部位的T reg 细胞和PD-1 + 细胞的比例较腹水中高，进一步证明了与恶性腹水相比，肿瘤组织中存在更多的免疫抑制状态。此外，CXCL13 + T H 1样细胞（T05）也富集在肿瘤部位，而CD4 + ANXA1 + T CM 细胞（T02）和CX3CR1 + T eff 细胞（T04和T09）主要检测到在血液和腹水中。具体而言，作者确定了两个占据CD8 + T细胞大部分比例的CD8 + T细胞亚型，其中T07 ANXA2 + T EM 富集在肿瘤部位，而T08 GZMK + T EM 富集在腹水中（图2b）。基于有限的差异表达基因，作者观察到富集在肿瘤中的ANXA2 + T EM 细胞表达了编码效应分子（如GNLY、GZMB和TNFSF10）的基因水平增加（图3e），表明肿瘤内T EM 细胞具有固有的抗肿瘤效应潜力。相比之下，富含腹水的GZMK + T EM 细胞表达EOMES和TCF7的水平更高（参考文献 21 ），这些基因是前体T EX 细胞中的关键转录因子基因，这表明GZMK + T EM 细胞更有可能转变为T EX 细胞。
结合TCR-seq和单细胞转录组学，作者捕获了54,061个T细胞中至少一对完整的有效α链和β链，其中21.12%（11,415个细胞）携带了2,386个克隆型的重复TCR（图2a）。然后，作者使用先前开发的STARTRAC指数对T细胞动态进行定量评估，通过TCR追踪（方法）。携带重复TCR的T细胞被定义为克隆细胞。在同一亚型内的多个不同组织部位存在克隆细胞，意味着指示的T细胞亚型的组织迁移（STARTRAC-migr）。在T细胞亚型内发现的克隆细胞通过STARTRAC-expa指数进行定量，而两个不同T细胞亚型之间的克隆细胞则涉及细胞状态转换（STARTRAC-tran）。在所有CD8 T细胞中，T细胞显示出最高的克隆扩张、迁移和转换指数（图2c），符合预期。此外，expa指数指出克隆扩张可能是T细胞在肿瘤部位富集的可能解释（图2c），与先前的研究结果一致。值得注意的是，作者观察到在两个肿瘤部位和腹水（Met.Ome-AS，Pri.OT-AS和Pri.OT-Met.Ome）之间T细胞受体（TCR）的强烈共享。考虑到疲惫的T细胞迁移能力较差，这似乎是合乎逻辑的，因为这些T细胞将在不同的组织中识别相同的肿瘤源性新抗原。
为了解T细胞的潜在发育轨迹，作者进行了PAGA和Palantir分析，排除了两个非传统亚型集，因为它们具有不同的TCR特征。作者注意到富集在腹水中的GZMK T（T08）位于中央，连接着T（T06）、T（T09）和T（T10）细胞（图2d），表明它们处于中间状态。此外，基于TCR共享的STARTRAC成对转换分析还显示，GZMK T表现出高转换为T、ANXA2 T和T细胞的能力（图2e），进一步支持作者推断的轨迹分析。据报道，CD8 GZMK T细胞被定义为肿瘤内的“预耗竭”细胞，它们通过局部扩增和补充积累，并且可以进一步转变为终末耗竭T细胞。同样，在作者的研究中，与其他T细胞相比，T08 GZMK T也具有更高的转变为T细胞的能力。2e。图4c），表明GZMK + T EM 的转变是T EX 细胞的重要来源。考虑到GZMK + T EM 细胞主要富集在腹水中，它们与肿瘤富集的亚型（T EX 和ANXA2 + T EM ）的转变可能与跨组织迁移同时发生。因此，作者进一步检查了GZMK + T EM 与T EX /ANXA2 + T EM 在不同组织之间的TCR共享，并发现肿瘤部位的T EX 和ANXA2 + T EM 细胞与腹水来源的GZMK + T EM 细胞共享更多的TCR克隆，而不是肿瘤来源的GZMK + T EM 细胞（图2f）。结果表明，腹水来源的GZMK + T EM 细胞可能是浸润肿瘤部位并进一步转变为T EX 或ANXA2 + T EM 的重要来源。此外，腹水中的GZMK + T EM 与Met.Ome中的T EX 或ANXA2 + T EM 细胞共享更多的TCR克隆，而不是Pri.OT中的细胞（图2g)，反映了腹水来源的GZMK + T EM 浸润到Met.Ome的偏好。然后，作者检查了腹水来源的T EM （T08）和肿瘤来源的T07、T08和T EX （T10）之间共享的TCR，以确认腹水T EM 和肿瘤T EX 细胞之间的联系。值得注意的是，与肿瘤T10克隆与肿瘤中的T07和T08亚型相连的情况相比，与腹水来源的GZMK + T EM 相连的肿瘤T EX （T10）克隆显示出互斥的模式（图2h）。考虑到耗竭的难以逆转性和T EX 细胞的缺乏活动性，这些结果进一步支持了肿瘤中的T EX 细胞可能来源于腹水中的GZMK + T EM 的观点，包括跨组织迁移和状态转换的过程。此外，作者还检查了腹水T EM （T08）和肿瘤T EX （T10）之间共享的TCR克隆是否也存在于血液或淋巴结中。作者发现，腹水T EM （T08）和原发肿瘤（61.73%）或转移性肿瘤（77.8%）在血液或淋巴结来源的T细胞中无法检测到（图2h），进一步支持腹水T EM 细胞可能是肿瘤浸润淋巴细胞的重要直接来源的观点。为了找到那些在血液/淋巴结中无法检测到的TCR克隆可能来自何处的线索，作者检查了所有富集在腹水中的T EM 细胞（T08）的起源。作者发现15.36%的腹水T EM （T08）细胞的TCR可以在血液和淋巴结中检测到，而9.57%和3.34%的腹水克隆性T EM 仅与血液T细胞或淋巴结T细胞共享TCR。综上所述，这些发现揭示了OC中CD8 + T细胞的循环，并暗示腹水来源的GZMK + T EM 细胞可能作为肿瘤浸润T EX 细胞的直接来源。
类似的分析也在CD4 T细胞上进行，以量化它们的组织分布和TCR共享。与CD8 T细胞相比，CD4 T细胞的克隆扩张程度总体较低。在这些聚类中，CD4 T细胞表现出最高的克隆扩张、迁移和转变指数（图3a），与CD8 T细胞的观察结果相似。推断的发育轨迹也呈现出类似的分支结构。T（T01）、T1样细胞（T05）和T（T03）细胞位于三个不同的分支上，而T（T02）细胞位于中间（图3b）。此外，基于TCR共享的成对转变分析（图3c）以及T02、T03和T05之间的共享TCR模式还揭示了T细胞与T1样细胞和T细胞的关联，表明T细胞可能是CXCL13 T1样细胞的潜在前体。鉴于T CM 细胞在腹水中富集，而T H 1样细胞在肿瘤中富集（图2b），它们的转变伴随着腹水向肿瘤的跨组织迁移，即CD4 + 记忆T细胞。然后，作者注意到肿瘤T H 1样细胞和腹水中的T CM 共享的TCR克隆几乎在肿瘤、血液和淋巴结中的其他T细胞中都无法检测到（图3d），这意味着腹水来源的T CM 细胞可能是肿瘤中T H 1样细胞的直接来源。此外，作者观察到与腹水中的T CM 和Met.Ome中的T H 1样细胞之间共享的TCR克隆更多，相比之下，Pri.OT中的共享TCR克隆较少（图3e），这表明腹水来源的T CM 细胞更有可能浸润到Met.Ome中。T CM 细胞浸润的这种组织偏好可能是解释Met.Ome中T H 1样细胞相对富集的潜在原因（图3f）。
DC亚群显示组织特异性模式
对于髓系细胞，无监督聚类产生了15个具有明显基因特征的聚类（图4a）。HLA hi CD14 − DC亚群（M01-M04）进一步被区分为CD1C + DC（cDC2）、CLEC9A + DC（cDC1）、LAMP3 + DC和LGALS2 + DC。值得注意的是，LAMP3 + DC聚类还被注释为“mregDC”，因为其高表达成熟和免疫调节标记基因（如CCR7、IL12B、CD274、PDCD1LG2和LAMP3），这是一种在摄取肿瘤抗原后诱导的细胞状态。与其他癌症类型报道的组织分布模式一致，LAMP3 + DC在肿瘤和淋巴结中显示出相对可比的富集。由于LAMP3 + DC表达了编码共刺激分子CD40的基因，该分子与髓系细胞和T细胞之间的相互作用有关，以及促进T H 1发育的IL12B基因。6a)，作者推测LAMP3 + DCs可能也有助于卵巢肿瘤中T H 1样细胞的浸润和分化。这可以解释Met.Ome中LAMP3 + DCs和T H 1样T细胞的富集指数比Pri.OT高的原因（图4b））。值得注意的是，作者在肿瘤组织中没有检测到许多常规DCs（cDCs），而是观察到它们在恶性腹水中的特定富集（图4b）。为了进一步阐明不同髓系亚型之间的功能和关系，作者对作者数据集中的髓系细胞与结直肠癌（CRC） 28 和肝细胞癌（HCC） 27 中报道的细胞进行了相似性分析（图4c）。如预期，来自不同癌症类型或组织来源的cDC1和cDC2被聚类在一起，表明它们具有保守的表型（图4c）（图6d））。作者还检查了肿瘤中LAMP3 + DC的潜在起源，并观察到更多来源于cDC2的LAMP3 + DC（图6e)，这可能与腹水中cDC2的比例较高有关。
肿瘤富集和腹水富集的巨噬细胞
至于单核/巨噬细胞组分，两个富含血液的聚类（M05和M06）分别被确定为CD14 + 单核细胞和FCGR3A + 非经典单核细胞。其余的聚类都被鉴定为巨噬细胞（M07-M15），基于CD68的高表达（图4a））。值得注意的是，在肿瘤和腹水中检测到的巨噬细胞主要通过其组织分布进行聚类。除了增殖的巨噬细胞（M13和M15）外，在肿瘤部位相对富集的聚类（M07、M10和M12）被称为肿瘤富集巨噬细胞（TeMs），而在腹水中相对富集的聚类（M08、M09、M11和M14）被称为腹水富集巨噬细胞（AeMs）（图4b））。在TeMs中，C3 + M12是分布在Pri.OT和Met.Ome中的主要亚群，而EREG + M07和C1QA + M10倾向于在Met.Ome中富集。同样，四个AeM亚群通过其特征基因进一步标记，从而将其分类为FN1 + M08，FABP5 + M09，VCAN + M11和FOLR2 + M14。
为了进一步了解不同组织和肿瘤类型中巨噬细胞亚群的异质性，作者还评估了作者研究中巨噬细胞亚型与HCC和CRC中报道的亚型的相似性，如上所述。C3 + TeMs（M12）和C1QA + TeMs（M10）被聚类到同一分支中，类似于结肠癌中鉴定出的IL1B + 宏噬细胞和C1QC + TAMs（图4c）。这些亚型高度表达C1QA和与抗原呈递相关的主要组织相容性复合物（MHC）II类分子（图4a）。值得注意的是，C3 + TeMs不仅表达与吞噬和炎症相关的基因（C3、CCL4和TNF） 31 ，还上调了与肿瘤反应相关的转录组程序（APOE、SPP1和TGFBI） 32,33 （图4a），这与CRC中的IL1B + 宏噬细胞 28 不同。相反，EREG + TeMs（M07）表达了高水平的趋化因子，如CCL20，CCL4，CXCL10，CXCL8和与血管生成相关的基因VEGFA，以及低水平的与HLA相关的基因，类似于CRC中鉴定出的SPP1 + TAM（图4a，c）。在AeM细胞中，FABP5 + AeM（M09），FOLR2 + AeM（M14）和FN1 + AeM（M08）都与HCC腹水富集的C6-MARCO聚类在同一分支中，可能反映了巨噬细胞的环境可塑性。值得注意的是，VCAN + AeM（M11），其特征是与单核细胞相关的转录本（VCAN，S100A9和S100A12）的高表达 34 ，与HCC数据集中富集于肿瘤的C5-VCAN和腹水富集的C1-THBS1以及CRC中的FCN1 + 单核样细胞聚类在同一分支中（图4c）。这两种巨噬细胞在HCC中被定义为髓系来源的抑制性细胞（MDSCs） 27 。因此，作者研究中的VCAN + AeMs（M11）更有可能是分布在腹水中的MDSCs。
作者接下来研究了TeMs（M07、M10和M12）和AeMs（M08、M09、M11和M14）的不同功能状态。作者观察到TeMs主要表达MHC-II分子和CD74，这对于抗原处理和呈递给CD4 T细胞至关重要。TeMs还上调了VEGFA的表达，暗示组织巨噬细胞在促进肿瘤血管生成中起到了作用。此外，作者观察到TeMs中上调了趋化因子（如CCL3/4/5和CXCL10/11/12）的表达，表明肿瘤巨噬细胞在招募T细胞方面的重要性。肿瘤组织内的细胞间相互作用分析也证实了TeMs通过CXCL10/11-CXCR3、CCL3/4/5-CCR5和CXCL12-CXCR4信号通路积极参与T细胞的招募。在原发肿瘤中，EREG + 宏观（M07）表达了增加的CXCL10/11水平，而C3 + 宏观（M12）高度表达CXCL12；然而，在转移性肿瘤中，令人惊讶的是发现CXCL10/11的主要来源从EREG + M07转变为C3 + M12和C1QA + M10上调了CXCL12的表达水平，表明转移性肿瘤中巨噬细胞的重编程。此外，EREG + TeM（M07）和C3 + TeM（M12）还显示了对分子CCL4和CCL5的优先表达，这些分子与CD4 + T reg 细胞高度表达的CCR4和CCR8受体结合。作者还发现TeM与腹水T细胞之间存在非常相似的相互作用模式。总的来说，作者的数据表明TeM在招募T细胞和塑造肿瘤中的免疫抑制微环境方面具有功能。
OC中的TeMs和AeMs的二分发生
最近的小鼠研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可能具有RTM和单核细胞起源。在这里，为了进一步推断TeMs和AeMs的起源，作者使用一组组织驻留相关基因，包括CD163、LYVE1、FOLR2、MRC1和TIMD4（图5a、b）定义了一个RTM评分。三个TeM亚群中的两个（M07和M12）的RTM评分比M10要低得多，而AeM聚类中约一半的细胞（M09和M14）的RTM评分相对较高（图5a）。此外，一组单核细胞源性巨噬细胞相关基因被用来补充巨噬细胞起源的分析。结果显示出类似的趋势，M07和M12表现出最高的单核细胞源性潜力。这些发现暗示OC中鉴定出的巨噬细胞有两种可能的起源，肿瘤中以单核细胞源性巨噬细胞为主要成分，而RTMs在腹水富集亚群中占据很大一部分。据报道，尽管成年组织中的RTM逐渐被循环单核细胞所取代，但仍然存在一种自我维持的RTM人口，这些RTM起源于胚胎前体 43 。为了探索胚胎腹膜巨噬细胞对卵巢肿瘤携带小鼠的腹水富集RTM的贡献程度，作者采用了Ms4a3 Cre -Rosa TdT 单核细胞命运映射小鼠模型 42 ，精确计量恶性腹水中巨噬细胞的不同发生学。根据流式细胞术数据，近一半的AeMs是胚胎来源的巨噬细胞，tdTomato − 细胞比例约为45%。此外，恶性腹水中约70%的CD163 + TIM4 + RTM是由胚胎前体贡献的（图5c）。这些结果表明，胚胎巨噬细胞是AeMs的重要来源，对OC腹膜微环境中RTM的维持起着贡献。
间质细胞对塑造腹水肿瘤微环境起到贡献作用
对于非免疫细胞，作者首先解剖了本研究中揭示的所有19个基质亚型的基因特征和组织分布（图6a、b），包括9个成纤维细胞亚型（COL1A2 + PDGFRA + ）、4个间皮细胞（MC）亚型（MSLN + UPK3B + ）、4个外膜细胞亚型（CSPG4 + TRPC6 + ）和2个血管平滑肌细胞亚型（MYH11 + CNN1 + ） 46,47 。在MCs中，DES + MC（S11）是腹水中占主导地位的基质亚型（图6b、c），这一点通过多色免疫组化（图6d）得到了证实。相反，VCAN + MCs（S13）在Met.Ome中富集（图6b）。先前的研究表明，在OC腹膜转移过程中，MCs会发生形态学变化并从腹膜表面脱落 16 。因此，作者比较了肿瘤源性MCs中细胞粘附相关基因（CD44、ICAM1、ITGAV、ITGB1、ITGB8、VCAM1、VCAN、CADM3和CLDN1）的表达水平，并发现DES + MCs的表达水平最低（图6e)，表明DES + MCs更有可能从肿瘤组织中脱落进入腹水。同时，作者观察到Met.Ome中MCs的细胞粘附潜力明显降低，与Pri.OT相比(图6f)）。这些分析表明，细胞间粘附的丧失可能是MCs从网膜脱落进入腹水的原因之一，这为肿瘤细胞的转移和定植提供了有利条件。
与化疗反应相关的内皮细胞表型
在所有内皮细胞中，根据PROX1（参考文献 50 ）的表达，E07和E08被注释为淋巴内皮细胞，而其他聚类则被确定为血管内皮（图7a）。已有报道称，肿瘤血管生成主要经历两个交替的过程，包括由迁移尖端内皮细胞进行血管萌发和萌发延长 51 ，这表明尖端细胞可以加速血管生成，而其他内皮细胞相对静态。在这里，聚类E03显示出与内皮细胞迁移和基质重塑相关的基因高表达 50 （图7b），类似于在肺肿瘤中检测到的尖端细胞，这表明患者预后不良 50 。
MAIT在腹水中作为铂类药物反应的潜在预测因子
据报道，卵巢癌患者腹水积聚与化疗反应和预后有关。在这里，作者进一步研究了响应和非响应患者腹水微环境的不同组成。通过使用Milo对所有腹水来源的T细胞进行线性模型分析，作者注意到在治疗前，响应患者的腹水中MAIT细胞富集，这得到了R数据的支持（图8a，b）。据报道，MAIT细胞可以在病理过程或肿瘤组织中积聚和发挥功能。在作者的研究中，MAIT细胞主要检测到在外周血和腹水中（图2b）。作者能够检测到腹水和血液来源的MAIT细胞之间的50个独特的共享TCR克隆（图8c），这表明外周血可能是腹水MAIT细胞的潜在来源。此外，富集在腹水中的MAIT细胞上调了归巢受体CXCR3和CXCR4，它们与CXCL12和CXCL10结合，这些分子也被其他富集在腹水中的细胞（如cDC1和DES MC）上调（图8d-f），进一步支持MAIT细胞的趋化作用。腹水富集的MAIT细胞还显示出与细胞激活相关的基因的优先表达（TMIGD2、CCL4和CCL5）（图8d、e），表明其处于激活状态。接下来，作者比较了对化疗有反应和无反应的患者腹水富集的MAIT细胞的特征。从对化疗有反应的患者中捕获的MAIT细胞过度表达与T细胞激活相关的基因，如ZFP36、JUN、DUSP1、NCR3和KLRB 55–57 ，而对化疗无反应的患者的MAIT细胞高度表达与免疫抑制相关的基因，如LAG3和IFITM3（图8g），这表明在对化疗有不同反应的HGSOC患者的腹水中，MAIT细胞也表现出不同的功能和表型。总的来说，这些结果表明，免疫激活的MAIT细胞可能有助于患者从化疗中受益，而对化疗无反应的患者的腹水中的MAIT细胞更可能出现功能障碍。此外，腹水中激活的MAIT细胞水平可能是预测化疗有效反应的有用且非侵入性的指标。
总结