今天给同学们分享一篇生信文章“Single cell sequencing analysis constructed the N7-methylguanosine (m7G)-related prognostic signature in uveal melanoma”，这篇文章发表在Aging (Albany NY)期刊上，影响因子为5.2。
结果解读：
图1展示了作者的工作流程
数据的单细胞分析
作者的分析中包括了11个UVM样本。这11个样本之间的批次效应可以忽略不计，因此适合进行后续分析（图2A）。在对数据进行质量控制和聚类分析后，所有细胞被分为67个亚群（图2B）。根据特征基因的表达，所有细胞被注释为五种细胞类型：B细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、光感受器细胞、浆细胞和T细胞（图2C、2D），以及肿瘤细胞。如图2E所示，m7G表型的激活在不同的细胞类型中有所变化。使用差异分析，设定调整后的p值<0.05，并选择| avg_log FC |> 0.3的基因，定义了与m7G表型密切相关的1153个基因。
WCGNA分析筛选出与m 7 G表型相关的模块和基因
每个细胞的M7G表型的富集分数（M7G分数）首先通过ssGSEA分析计算得出。为了进一步寻找与M7G表型相关的基因，进行了WGCNA分析。在图3A中，当设置软区域阈值达到9时，R > 0.8，表明数据符合幂律分布，并适合于WGCNA分析。此外，随着软域值的增加，平均连接性波动很小。如图3B所示，所有基因被集体聚类成六个非灰色模块，并发现在这些模块中（图3C），蓝绿色模块与M7G分数具有最高的相关性，R = 0.56，p <0.001。在图3D中，模块成员关联与体重基因重要性的相关系数为0.67，p <0.001。因此，从蓝绿色模块中选择了5,757个基因，并包括在随后的分析中。
预测性标记的构建
在将从单细胞数据分析得到的1153个基因与上述WGCNA分析得到的基因相交集后，共得到355个基因。最终，确定了315个适合进一步分析的基因。然后，作者进行了单变量Cox分析以筛选与预后相关的基因。作者发现有45个基因具有显著的预后价值（p<0.05）（图4A）。
免疫浸润和免疫检查点分析显示风险评分与免疫之间存在强烈的相关性
作者进一步分析了高风险组和低风险组之间的肿瘤免疫微环境。使用多个免疫浸润算法，作者绘制了一个基于病例的热图，显示了两组之间得分显著不同的浸润算法（图5A）。此外，作者比较了79个免疫检查点基因的表达情况，这些基因已被先前的研究人员确认，并进行了Wilcoxon检验（图5B）[25]。如图5C、5D所示，与低风险组相比，高风险组中肿瘤坏死因子和白细胞抗原基因的表达均有所增加。
肿瘤突变分析
在图6A中，高风险组中，前五个发生突变的基因分别是GNA11、GNAQ、BAP1、SF3B1和C3。然而，在低风险组中，前五个基因是GNA1、SF3B1、GNA11、EIF1AX和BAP1（图6B）。常见的突变基因是GNA11和BAP1。有趣的是，GNAQ基因突变，在G通路中是一种经典的改变，在高风险组中更常见，暗示了作者的标志与G通路之间的潜在相关性。
建立一个等高线图
如图7A所示，TCGA-VD-AA8N患者的1年、3年和5年死亡率分别为0.0439、0.47和0.939。此外，ROC C指数为0.849，95%CI：(0.771, 0.928)，表明该评分图在评估患者预后方面具有高准确性。此外，连续预后ROC分析发现，评分图评估患者预后的ROC曲线下面积超过0.8，高于其他临床特征（图7B）。此外，如图7C所示，根据评分图进行的临床干预对患者的效果优于其他临床特征，如性别、年龄、肿瘤大小和分期。
体内研究验证了基因PAG1的致癌潜力
为了进一步验证作者先前构建的风险模型的稳健性，作者使用体内实验来验证UVM患者中一个基因在签名模型中的致癌作用，该基因为PAG1。因为PAG1的过表达能够最显著地提高作者先前构建模型的风险评分，所以作者进行了基因mRNA水平的遗传操作。首先，作者发现在3个变异细胞系中，PAG1基因的表达在siRNA转染后显著受抑制（图8A）。细胞增殖实验显示，在PAG1基因敲除后，MUM-2B和OCM-1细胞系的增殖速率显著降低（图8B，8C）。划痕和伤口愈合实验显示，在PAG1基因敲除后，MuM2B细胞和OCM-1细胞的迁移能力显著受损（图8D）。此外，Transwell实验显示，在PAG1敲除后，通过Transwell板迁移的细胞数量显著减少（图8E）。综上所述，这些结果表明PAG1基因在UVM细胞系的增殖和迁移中起着关键作用。
总结