题目：OLR1是HNSCC中与EMT和铜死亡相关的泛癌预后和免疫治疗的预测因子
杂志：Int J Mol Sci
影响因子：IF=5.4
发表时间：2023年8月
研究背景
新陈代谢在癌症中起着关键作用。OLR1与心血管和代谢紊乱有关，但其与肿瘤发生和肿瘤免疫的关系暂不清楚。上皮-间充质转化(EMT)过程和肿瘤干细胞被广泛认为是肿瘤发生、复发和转移的罪魁祸首，对ICI治疗的疗效有重要影响。铜死亡是一种程序性细胞死亡形式，与细胞代谢密切相关。然而在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)中，OLR1与EMT和铜死亡之间的作用机制暂不清楚。
数据来源
研究思路
基于TCGA数据库，采用t检验进行OLR1在泛癌中的差异表达分析。使用R包“survminer”和“survival”进行Kaplan-Meier和Cox回归分析，探讨OLR1对患者预后的影响。利用蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络和富集分析以及STRING数据库构建OLR1的PPI，最低要求互动得分设定为0.4。使用clusterProfiler软件包对OLR1进行GO和KEGG富集分析。
采用Spearman相关性分析探讨泛癌组织中6种免疫细胞与OLR1表达的关系。此外，使用TIMER2.0数据库评估免疫检查点和EMT相关基因表达与OLR1表达的相关性。通过免疫组化检测HNSCC中OLR1的表达。利用GSEA方法探索OLR1参与的潜在信号通路，并通过相关分析研究了OLR1与EMT过程和铜死亡之间的关系。此外，通过划痕、Transwell、CCK8、成球实验和流式细胞术检测敲低OLR1对HNSCC细胞EMT过程、侵袭、干细胞特性和铜死亡的影响，并通过Western Blot检测相关蛋白的变化。
主要结果
1 OLR1在泛癌中异常表达及其预后价值
基于TCGA数据库，初步探究了33种癌症中OLR1 mRNA表达水平。结果表明，OLR1在大多数癌症中显著上调，只有少数例外。并且与正常组织相比，OLR1在DLBC、LUAD、LUSC、SARC和TGCT中的表达下调(图1A)。此外，配对比较分析显示，与邻近正常组织相比，OLR1在BRCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSCC、KIRC、KIRP、PRAD、STAD和THCA中的表达显著升高。相比之下，OLR1在LUAD和LUSC的肿瘤组织中表达降低(图1B)。
为了研究OLR1表达在33种不同类型癌症中的预后意义，本研究使用Cox比例风险模型进行了生存分析。研究结果表明，OLR1表达水平升高的患者在CESC、COAD、HNSCC、LGG、SARC、STAD、THCA和THYM中出现了更差的OS。相反，在CHOL、LUAD和SKCM中，OLR1高表达水平的患者预后较好(图2A)。Kaplan-Meier生存分析进一步验证了这一观察结果(图2B-K)。总的来说，OLR1的表达水平在各种癌症的进展中显著升高，并有可能作为一种有前景的泛癌预后生物标志物，特别是对于COAD、HNSCC、LGG和CHOL。
2 泛癌组织中OLR1的免疫细胞浸润分析
肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。本研究采用CIBERSORT、EPIC、TIME算法评估OLR1表达与免疫细胞浸润水平的相关性。这些算法的结果表明，OLR1的表达与几种细胞类型呈正相关，特别是巨噬细胞、骨髓树突状细胞、调节性T细胞和癌症相关成纤维细胞，而与一些特定的T细胞亚型，如naive和Th1 CD4+ T细胞呈负相关(图3)。
此外，本研究探讨了泛癌中OLR1与17种常见免疫检查点表达的相关性。值得注意的是，除了DLBC和TGCT外，OLR1在几乎所有癌症中都与大多数免疫检查点分子呈正相关，与HAVCR2的相关性尤其强(图4A)。并且在多种癌症中，OLR1的表达水平与MSI和TMB有很强的相关性(图4B,C)。特别是在BLCA、COAD、PRAD、SARC和THYM中，OLR1与TMB呈正相关，而在LIHC、LUAD、LUSC和PAAD中，OLR1与TMB呈负相关。此外，在COAD和READ中，OLR1与MSI呈正相关；相反在HNSCC、LGG、LUSC、OV、SKCM和STAD中与MSI呈负相关。综上所述，OLR1在各种癌症中的表达水平与多种免疫细胞的浸润密切相关，可以作为肿瘤抑制免疫反应的标志，并有望作为ICI反应的预测因子。
3 泛癌中OLR1相关基因富集分析
为了进一步阐明OLR1在肿瘤发生中的分子机制，本研究对从STRING数据库中获得的与OLR1相互作用的前100个蛋白进行了GO和KEGG富集分析。结果显示生物过程(BP)主要与“对细菌分子的反应”、“对脂多糖的反应”、“炎症调节”和“细胞-细胞粘附调节”相关;细胞成分(CC)富集与“质膜外侧”、“内吞囊泡”和“三级颗粒膜”有关;富集的分子功能(MF)与“脂蛋白颗粒结合”、“货物受体活性”和“清道夫受体活性”有关(图5A)。
通过KEGG分析，本研究发现OLR1与“肿瘤中PD-L1表达和PD-1检查点通路”、“nod样受体信号通路”、“TNF信号通路”和“toll样受体信号通路”密切相关(图5B)，提示OLR1可能在肿瘤免疫调节中发挥作用。此外本研究还发现OLR1与HIF-1以及NF-κB信号通路之间存在密切联系，提示OLR1可能在肿瘤发生和转移过程中发挥重要作用。而且，GO和KEGG分析都表明OLR1与细胞间粘附有关，这表明它可能参与调节细胞迁移。此外，本研究使用STRING数据库构建了OLR1和前10个相关基因 的PPI网络(图5C)。本研究发现大多数这些基因被报道与肿瘤进展有关。随后使用CellMiner数据集研究了OLR1是否影响抗肿瘤药物敏感性，结果发现OLR1与对长春新碱和紫杉醇等药物的耐药性相关(图5D)。这些结果表明，OLR1的表达可能影响某些癌症化疗的疗效。
4 OLR1在HNSCC中的过表达与免疫治疗耐药
以上结果表明，OLR1可能在HNSCC中起重要作用。因此，本研究进一步分析了OLR1影响HNSCC进展的潜在机制。首先，本研究发现与正常对照样本相比，HNSCC肿瘤组织中OLR1表达水平显著增加(p < 0.001，图6A,B)。然后，本研究分析了OLR1表达与临床特征的相关性，发现高T分期(TNM分期)的HNSCC患者的OLR1表达水平高于低T分期的HNSCC患者(T1 vs. T3和T4, p < 0.05，图6C)。此外，OLR1的表达与较高的病理分级呈正相关(I vs. II, p < 0.01;I vs. III and IV, p < 0.01，图6D)。然后，本研究进行了免疫组化染色，证实了LOX-1在人和小鼠HNSCC中都过表达(p < 0.05和p < 0.01，分别见图6E,F)。值得注意的是，单因素和多因素Cox回归分析均表明，OLR1可以作为HNSCC患者OS的独立预后因素(p = 0.004和p = 0.013，图6G)。此外，在GSE41613数据集中使用log-rank检验的Kaplan-Meier生存分析强化了本文的发现，表明OLR1表达水平升高的HNSCC患者预后较差(p = 0.01，图6H)。因此，这些结果表明，OLR1过表达与HNSCC的侵袭性癌症行为和不良预后密切相关。
然后，本研究使用TIDE算法来评估免疫治疗在不同OLR1表达亚群中的潜在临床疗效。研究结果显示，与免疫治疗耐药的HNSCC患者相比，OLR1表达在免疫治疗反应中显着降低(图6I)。此外，OLR1高表达亚组的TIDE评分明显高于OLR1低表达亚组，这意味着OLR1高表达的HNSCC患者比OLR1低表达的HNSCC患者更有可能对ICI治疗产生耐药性(p < 0.001，图6J)。而且本研究发现OLR1低表达亚组的MSI评分更高(p < 0.001，图6K)，而OLR1高表达亚组的T细胞排斥和T细胞功能障碍评分更高(p < 0.05和p < 0.001，图6L,M)。这些结果表明，OLR1的表达与肿瘤免疫逃逸有关，靶向OLR1可能增加肿瘤T细胞浸润和MSI，从而提高对ICI治疗的应答率。
5 敲低OLR1通过STAT3途径抑制HNSCC细胞的EMT过程和干细胞特性
考虑到OLR1表达与HNSCC临床结果之间的关联，本研究随后分析OLR1促进HNSCC进展的潜在机制。利用TCGA-HNSCC数据集对OLR1进行基因集富集分析(GSEA)，结果发现OLR1可能参与多种致癌信号通路。值得注意的是，OLR1与EMT过程之间存在很强的正相关(图7A)。此外，OLR1与间充质标志物(FN1、VIM和MMP9)和EMT – TFs (SNAI1和ZEB1)呈显著正相关(图7B)。EMT过程已被广泛证明与多种肿瘤的侵袭、转移、免疫抑制和治疗耐药相关。
因此，为了进一步验证OLR1是否影响HNSCC的EMT过程，本研究利用siRNA降低了OLR1在HNSCC细胞系Cal27和SCC4中的表达。Western blotting结果显示，OLR1缺失后Cal27和SCC4的“间质”特征(N-cadherin和Vimentin)减弱，而“上皮”特征(E-cadherin)显著增强(图7C)。这一结果表明，敲低OLR1限制了HNSCC的上皮-间质可塑性。随后，通过细胞划痕实验，发现敲低OLR1细胞的愈合能力明显受到抑制(p < 0.001，图7D)。此外，本研究通过Transwell实验验证了OLR1敲低后Cal27细胞的侵袭能力明显受到抑制(p < 0.01，图7E)。
接下来，本文研究了OLR1在HNSCC中的调控机制。GSEA分析结果表明，OLR1与STAT3信号通路相关(图7A)， STAT3信号通路是侵袭和干细胞特性维持的重要信号通路。与此结果一致，OLR1敲低显著降低了酪氨酸磷酸化激活STAT3和干性标记(CD44)的表达(图7F)。此外，OLR1的下调抑制了HNSCC细胞的增殖能力和成球能力(p < 0.01和p < 0.05，图8A,B)。而且，ALDEFLUOR实验显示，siOLR1组中ALDHhigh细胞的比例减少，这表明OLR1在调节HNSCC的干细胞特性中起关键作用(p < 0.01和p < 0.05，分别见图8C、D)。综上所述，这些数据表明OLR1在HNSCC中通过STAT3通路维持EMT过程和干细胞特性。
6 在HNSCC细胞中，OLR1作为铜死亡的抑制因子
本研究整合了TCGA-HNSCC数据集，观察了OLR1与已知铜死亡相关基因(FDX1、DLAT、ATP7A、ATP7B、CDKN2A和GLS)之间的相关性(图9A)。结果发现elesclomol-Cu以浓度依赖的方式促进HNSCC细胞死亡(图9B)。重要的是，OLR1的敲低显著增强了elesclomol- cu诱导的细胞死亡(图9B)。流式细胞术实验进一步证实了这一发现(图9C)。此外，四硫钼酸盐(TTM)可以防止细胞死亡(p < 0.001，图9D)。此外，研究发现在elesclomol- cu治疗后，与对照组相比，OLR1沉默组的DLAT寡聚化更为明显(图9E,F)。综上所述，这些结果表明OLR1可能通过抑制DLAT的寡聚化来抑制铜死亡的发生。
文章小结