这篇文章由中国科学院生物物理研究所的王立堃团队完成
Li等人发现VMP1是未折叠蛋白反应(UPR)的调节因子。在vmp1缺失的细胞中，UPR的三个分支通过钙干扰和ER-线粒体相互作用受到差异调节。结果，VMP1缺乏尽管损害细胞生长，但是可以保护细胞免受慢性内质网应激，
Highlights
1.三个UPR分支在VMP1缺陷细胞中受到差异调节
2.钙直接激活vmp1缺失细胞中的PERK，而不受内质网应激的影响
3.线粒体应激和PERK启动ISR，使VMP1-KO细胞中的IRE1a和ATF6抑制
4.尽管对细胞生长不利，但VMP1缺乏赋予慢性内质网应激抗性
背景：
ER作为细胞内重要细胞器，参与蛋白质合成、折叠、翻译后修饰等细胞内重要生理过程。蛋白质的正确折叠对于蛋白质功能的发挥起关键作用。在ER中，存在各种调控机制，以确保蛋白质的正确折叠、修饰、组装以及正常运输[3]
但当缺乏营养物质、钙稳态不平衡、过度表达分泌蛋白、以及缺氧等状态时会造成不能正确折叠或成功分泌的蛋白质可能会在内质网管腔中积聚，未折叠蛋白或错误折叠在ER内大量积累，从而引起ERS。细胞发生ERS时，细胞为了挽救这种病理状态，会激活一系列互补的适应性机制来减少这种错误折叠或未折叠蛋白的积聚，恢复蛋白质稳态，这些机制被称为UPR
迄今为止，一共发现了三种UPR途径，即IRE1a、PERK和ATF6途径。在正常情况下，伴侣蛋白GRP78/BiP像一个帽子紧紧地扣在ER上的跨膜蛋白上，而发生内质网应激时GRP78/BiP与跨膜蛋白解离，而去结合未折叠或错误折叠蛋白，跨膜蛋白发生构象改变，三种内质网应激感受器/跨膜蛋白（IRE1α、Perk、ATF6）被激活 →进一步引发upr下游信号通路。
UPR信号广泛参与炎症、糖尿病、神经退行性疾病和癌症等疾病，然而目前对UPR的机制仍然没有完全阐明。
一些：
Proteins that fail to fold correctly or secrete successfully may accumulate in the ER lumen to cause ‘‘ER stress,’’ under which the unfolded protein response (UPR) is initiated.
IRE1a, PERK, and ATF6. These three proteins sense ER stress and activate multiple down-
stream signals to maintain ER homeostasis
“UPR的输出可能是细胞保护或破坏。对内质网应激的不适当反应可能导致疾病，其中细胞要么劫持UPR以适应恶劣环境，要么失去生理功能并发生凋亡”
The existence of mitochondria-ER contacts (MERCs) and entanglement（相互作用）between ER stress and mitochondrial stress suggest that homeostasis of the ER and mitochondria are closelyrelated, but whether and how ER stress and mitochondrial stress affect each other remains unclear.
结果：
R1
为了揭示UPR的调控机制，，作者构建了稳定表达IRE1a和PERK荧光报告基因的293T细胞，根据UniProt网站，作者挑选了54个ER跨膜蛋白，并使用CRISPR-Cas9技术敲除相应基因，进行了筛选，
VMP1敲除可以有力地诱导PERK活性，且对IRE1a信号没有影响，然而在Tm诱导的内质网应激下，VMP1敲除抑制了IRE1a信号。
在敲除VMP1的情况下，没有外部内质网应激时会诱导UPR中的PERK通路，而Tm诱导内质网应激时却抑制UPR的另一条通路IRE1a通路，这似乎是矛盾的。
内质网上的跨膜蛋白(TMEMs，根据UniProt (https:// www.uniprot.org/)，作者选择了54个已知或预测为er定位跨膜蛋白的TMEMs，并在表达UPR报告基因的细胞中使用CRISPR-Cas9系统27敲除每个TMEMs的基因，进行了一个小型筛选。
于是作者为了进一步验证VMP1的作用，构建了单纯VMP1敲除细胞系，并测量了所有三种已知UPR途径的标记物
VMP1 KO没有引发IRE1a的XBP1 mRNA剪接或磷酸化，IRE1a是IRE1a激活的两个标志物，也没有诱导ATF6的切割和核转位或ER管腔定位伴侣BiP的表达，即ATF6激活的标志物
然而，VMP1 KO导致PERK磷酸化（被认为是向更高分子量的带转移）、eIF2a磷酸化、ATF4表达和CHOP mRNA诱导，这些是即使没有ER应激处理也能激活PERK的经典标志物。
令人惊讶的是，当细胞受到Tm的攻击时，VMP1 KO抑制了IRE1a和ATF6的活性（图1C–1E）。值得注意的是，VMP1在VMP1 KO细胞中的再表达在没有Tm的情况下降低了PERK的活性，并在Tm的存在下恢复了IRE1a和ATF6的活性（图1C和1D），排除了VMP1 KO细胞中UPR改变是由脱靶效应引起的可能性。
在没有外部内质网应激的情况下诱导PERK通路和通过删除VMP1来抑制tm诱导内质网应激的IRE1a通路似乎不寻常和矛盾。
于是作者在293T中构建了不表达UPR报告者的VMP1敲除(KO)细胞系，并测量了所有三种已知UPR通路的标记，无论是否有内质网应激诱导剂
有趣的是，VMP1 KO没有引起XBP1 mRNA剪接或IRE1a的磷酸化(IRE1a激活的两个标记)，也没有诱导ATF6的切割和核易位或内质网腔定位伴侣BiP的表达，这是ATF6激活的标志，然而，VMP1 KO导致PERK磷酸化(被认为是向更高分子量的条带移位)、eIF2a磷酸化、ATF4表达和CHOP mRNA诱导，这些都是即使没有内质网应激处理也能激活PERK的典型标记
VMP1 KO对三条UPR通路的不同影响（即PERK在基础水平的特异性激活和IRE1a和ATF6在ER应激存在下的抑制）在另一种ER应激诱导剂Tg治疗和HCT116人结肠癌细胞系中也可以看到（图S1F-S1I）
模式图：
R2.
PERK通路的选择性诱导表明，VMP1缺乏可能不会导致整体内质网应激。在293T细胞中证实了这一点，其中Tm处理（而不是VMP1 KO）导致ER扩张（图2A）
而且，Tm诱导的PERK磷酸化可以通过化学伴侣TUDCA和蛋白质翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）来阻止，然而由于VMP1缺乏而导致的PERK的磷酸化则不能被抑制（图2B和2C），以上结果证明了VMP1 KO细胞中PERK磷酸化与内质网应激是无关的。
BAPTA-AM对胞质Ca2+的消耗抑制了VMP1中PERK的磷酸化KO 293T细胞(图2E)。
作者联想到VMP1已被既往文献证明是内质网Ca2+-ATP酶的正调节因子，于是作者用心脏ER/肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA）抑制剂Tg和环噻唑酸（CPA），发现在15分钟内可以增加mPERKDLD的磷酸化（S2B）
在VMP1 KO细胞中，Tg诱导的ER钙释放受到损害（图S2C–S2F）于是作者假设可能是VMP1 KO细胞中PERK激活是由于SERCA的功能障碍和Ca2+稳态被破坏所引起
并且，与Tg相比，VMP1缺乏仅导致SERCA的轻度功能障碍，并且不会引发内质网应激：（1）与Tg不同，VMP1 KO仅部分降低了内质网Ca2+含量（图S2C a n d S2 d）；（2）CDN1163能够抑制VMP1 KO引起的，但不能抑制Tgin诱导的PERK激活（图S2G）；和（3）在VMP1 KO细胞中未观察到ER扩张（图2A）。
VMP1缺失对SERCA的抑制可能会升高内质网膜胞浆侧的局部Ca2+浓度，据报道胞浆Ca2+升高会引发PERK二聚化。9我们发现BAPTA-AM对胞浆Ca2＋的耗竭抑制了VMP1 KO 293T细胞中的PERK磷酸化（图2E）。即使PERK管腔结构域不存在，情况也是如此（图2F）。这些结果表明，通过SERCA抑制增加的局部Ca2+浓度可能以ER应激无关的方式导致PERK活化。
R3
钙是如何激活PERK的？一种可能的解释是，某些Ca2+调蛋白可能与PERK相互作用。
作者用钙调神经磷酸酶，一种先前报道与PERK相关并促进PERK自磷酸化的Ca2+依赖性磷酸酶，然而，用小干扰RNA敲低钙调神经磷酸酶基因并不能抑制PERK的磷酸化（图S2I和S2J），这说明PERK的激活可能不是由Ca2+调蛋白与PERK相互作用引起。
作者假设PERK可以直接感知局部Ca2+浓度的变化。为了测试这一点，作者表达并纯化了63His标记的PERK（CD）（人类PERK的胞质结构域，残基563-1116）（图S2K），并通过热漂移分析测量了PERK（CD）-Ca2+的相互作用。
值得注意的是，低至10uM浓度的Ca2+能够提高PERK（CD）的熔化温度，这表明Ca2+可以与PERK（CD）结合并稳定（图2G和2H）。有趣的是，Ca2+在提高PERK（CD）的熔化温度方面比Mg2+表现得更好，（图2H）。
Mg2+是促进ATP结合的激酶辅助因子，在MgCl2存在的情况下，Ca2+以浓度依赖的方式促进PERK（CD）磷酸化（图2I），并在体外促进PERK的二聚化/低聚（图S2L）。然而，MgCl2不存在时Ca2+对PERK（CD）磷酸化没有影响（图2I），这表明Ca2+可能与Mg2+合作激活PERK。此外，离子霉素增加胞浆Ca2+水平也促进了体内mPERKDLD的磷酸化（图2J）。证明了假设即PERK的胞质部分可以在体外和体内感知和响应Ca2+浓度的变化。
R4
于是作者去探究UPR的另外两条途径IRE1a和ATF6在VMP1 KO细胞中是如何被下调的。有两种可能性：内质网应激减轻，或者IRE1a和ATF6变得惰性，对内质网应激没有反应。我们注意到野生型（WT）细胞在Tm处理后扩张ER，但VMP1 KO细胞没有（图3A）。这表明内质网应激实际上减弱了，内质网中的蛋白质积累减少了。
VMP1缺失促进了eIF2a的磷酸化（图1D a n d S1G），这是蛋白质翻译停滞的标志。
我们通过SUnSET测定测量了翻译水平，发现VMP1 KO降低了293T细胞和HCT116细胞的整体翻译（图3B）。我们提出假设：翻译阻滞可以减轻内质网负荷，减轻内质网应激并抑制IRE1a和ATF6途径。
为了验证这一假设，作者用ISRIB处理293T（WT或VMP1 KO），我们发现ISRIB在VMP1 KO细胞中恢复了蛋白质翻译并重新激活了IRE1a和ATF6（图3B–3D）。因此，以上结果证明，VMP1缺失通过eIF2a磷酸化减弱全局翻译来抑制IRE1a和ATF6活性。
R5
PERK（一种UPR和ISR成分）在VMP1 KO细胞中被激活的事实促使我们推测PERK激活有助于翻译衰减和IRE1a/ATF6抑制。这得到了以下结果的支持：PERK的基因缺失和药理学抑制都降低了eIF2a磷酸化和ATF4表达，恢复了蛋白质翻译，并恢复了IRE1a（IRE1a磷酸化、XBP1 mRNA剪接和XBP1s诱导）和ATF6信号（ATF6切割和BiP诱导）（图4A–4D和S3A–S3C）。值得注意的是，与PERK KO细胞相比，VMP1/PERK双KO（DKO）细胞仍然显示出翻译水平和IRE1a/ATF6活性降低，这表明VMP1 KO细胞中存在除PERK之外的其他因子来阻止翻译并抑制IRE1a和ATF6。
VMP1 KO细胞的一个特征是MERCs异常增加。作者在VMP1 KO293T细胞中观察到MERCs显著增加（图S4A和S4B）。我们想知道这是否减少了翻译并使IRE1a和ATF6失活。通过引入已报道的内质网线粒体合成接头（linker）来提高MERCs，蛋白质合成减少并抑制Tm诱导的IRE1a信号（XBP1 mRNA剪接、IRE1a磷酸化和XBP1表达）和ATF6信号（BIP mRNA诱导、BIP表达和ATF6切割）（图5A-5E）。
MERCs在从内质网到线粒体的Ca2+流量中起着重要作用。在VMP1 KO细胞中，Ca2+在线粒体的表达增加（S4D）。为了进一步证明MERCs在线粒体[Ca2+]升高中的作用，我们敲除了电压依赖性阴离子通道1（VDAC1），，VDAC1缺失减少了VMP1 KO细胞中的线粒体[Ca2+]（图S4E），部分恢复了整体翻译，并恢复IRE1a（XBP1 mRNA剪接）和ATF6（BIP转录诱导）下游的信号（图5F–5H）。因此，异常高的Ca2+从内质网到线粒体的转运有助于VMP1 KO细胞中IRE1a和ATF6的抑制。
线粒体钙超载可能对线粒体功能有害，导致线粒体应激。4这在VMP1 KO细胞中得到了证实，因为我们观察到线粒体呼吸受损（图S4F和S4G）和线粒体活性氧（ROS）增加（图S4H）。此外，VMP1缺失导致线粒体扩张，这是线粒体应激的另一个迹象，可以通过重新引入VMP1来逆转（图S4A和S4I）。重要的是，这是以不依赖于PERK的方式发生的，因为敲除PERK不能消除异常的线粒体形态（图S4J）。
接下来，我们决定模拟WT细胞中的线粒体应激，并分析其对蛋白质翻译和UPR信号的影响。我们使用了三种化学物质，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐（MPTP）、寡霉素和多西环素，分别增加线粒体ROS、损害线粒体呼吸和诱导线粒体扩张（图S5A-S5C）。与VMP1耗竭类似，这三种化学物质诱导的线粒体功能障碍足以减弱全局翻译并诱导eIF2a磷酸化，但不依赖于PERK，如使用PERK抑制剂所证明的（图5I）。药理学诱导的线粒体功能障碍也抑制了Tm或Tgin诱导的IRE1a和ATF6信号（图5J–5L、S5D和S5E）。这种效应不能被VMP1过表达逆转，这与我们的发现一致，即线粒体应激是VMP1缺陷的下游（图5J–5M）。
因此，除了PERK激活外，在VMP1缺陷的情况下，MERC诱导的线粒体应激在减弱蛋白质合成和失活UPR的IRE1a和ATF6分支方面起着另一个独立的调节因子的作用。
R7
据报道，线粒体功能障碍可激活三种ISR激酶（GCN2、PKR和HRI），这三种激酶与PERK平行，汇聚到eIF2a磷酸化和随后的蛋白质翻译减弱。2我们在VMP1 KO细胞中观察到PKR的磷酸化，但没有观察到GCN2的磷酸化。这表明PKR的激活（图6A和6B）。为了研究ISR在翻译衰减和URP失活中的作用，我们在VMP1 KO细胞中分别敲除了GCN2、PKR和HRI（图6C-6E）。与PERK缺失类似，PKR-KO或HRI-KO部分挽救了VMP1 KO细胞中的整体翻译，抑制了eIF2a的磷酸化，并恢复了内质网应激诱导的IRE1a和ATF6的激活。相比之下，GCN2 KO没有这种影响（图6F–6H）。因此，PKR和HRI，而不是GCN2，是解释VMP1缺失诱导的翻译衰减和IRE1a/ATF6抑制的ISR途径。
有趣的是，与PERK-KO不同，PKR或HRI的消融并不影响ATF4的表达。另一方面，尽管GCN2的缺失对eIF2a磷酸化和蛋白质翻译没有影响，但降低了ATF4的表达（图6F）。
这些结果表明，在VMP1 KO的情况下，AFT4以eIF2a磷酸化非依赖性的方式调节
R8
在解决了VMP1缺失对三种UPR途径的差异调节机制后，我们探索了这种调节在基础和内质网应激条件下的生理意义。在基础条件下，VMP1缺失特异性激活了PERK通路。同时，与WT细胞相比，VMP1 KO细胞的细胞增殖率降低。有趣的是，PERK的基因缺失或药理学抑制，或增加ISRIB的全局翻译，恢复了VMP1 KO细胞中的细胞增殖，表明PERK激活及其后的翻译抑制损害了细胞增殖（图7A、7B和S6A）。
接下来，我们研究了VMP1缺乏在内质网应激背景下的影响。为此，通过用Tm处理长达5天，用ER应激攻击细胞。正如预期的那样，WT和VMP1 KO细胞中的细胞活力逐渐降低。
有趣的是，虽然VMP1耗竭在内质网应激的早期阶段降低了细胞活力，但在晚期变得有益，在第3天发生转变，也就是细胞活力急剧下降的那一天（图7C）。VMP1 KO的抗细胞死亡作用在第3天变得明显，当时WT 293T细胞中的细胞死亡百分比增加（图7D）。通过使用其他内质网应激诱导剂（Tg或BFA）或另一种细胞系（HCT116），也可以观察到VMP1 KO对细胞活力的影响的逆转以及VMP1 KO在长期内质网应激下的抗细胞死亡作用（图S6B和S6C）。
UPR可以是保护性的，也可以是促凋亡的，这在很大程度上取决于UPR的强度、动力学和下游信号。3为了进一步揭示VMP1 KO对细胞活力影响的转变机制，检测了Tm处理后第1天至第3天细胞中的UPR标记物。BiP是ATF6下游的一种适应性UPR标记物。我们发现VMP1 KO在整个观察时间段内抑制了BiP的激活（图7E）。XBP1s和JNK磷酸化分别代表IRE1a下游的适应性和末端UPR信号。4在WT细胞中，XBP1s的表达在内质网应激的早期阶段（第1天和第2天）高度上调，但在第3天下降。JNK磷酸化表现相反，仅在第3天出现。值得注意的是，在整个观察时间段内，XBP1诱导和JNK磷酸化都受到VMP1 KO的抑制（图7E）。
我们发现，在内质网应激的早期阶段，VMP1 KO细胞中XBP1的缺乏损害了细胞的生存能力，因为过表达的XBP1恢复了生存能力（图7F[顶部]和S6D）。
使用IRE1a抑制剂预防WT细胞中的IRE1a过度激活可降低长期内质网应激下的细胞死亡率（图7F，底部）。与IRE1a通路类似，PERK在内质网应激下的细胞命运决定中发挥双重作用。尽管早期激活通过降低ER蛋白负荷启动即时适应性反应，但PERK的过度激活可通过诱导CHOP（凋亡相关转录因子）触发细胞死亡。4我们发现，在VMP1 KO细胞中，CHOP的表达在第1天高于WT，但在第2天和第3天被WT超过。因此，VMP1 KO以与内质网应激无关的方式开启PERK，但将信号强度保持在中等水平，以防止终末UPR的发生，但在延长的内质网应激下保留适应性UPR。无论哪种方式，这种优雅平衡的扰动都可能导致细胞死亡的增加，并会抑制VMP1缺乏在慢性内质网应激下的保护作用，正如已经证明的那样
通过mPERKDLD过表达和PERK KO（图7G和S6E）。此外，用ISRIB恢复蛋白质翻译或通过VDAC1 KO抑制内质网向线粒体Ca2+流动，如前所述，这恢复了UPR，也损害了内质网应激后期VMP1缺乏的保护作用（图7H和7I）。总之，在内质网应激的早期阶段，VMP1缺失通过抑制适应性UPR来损害细胞活力，并在应激持续且适应性UPR已经减弱时通过降低末端UPR来保护细胞免于死亡（图7J）