北大药学院
将非典型E3连接酶ZFP91促进小分子诱导的
E2F2转录因子降解用于癌症治疗
转录因子E2 因子 (E2F) 家族是参与细胞周期及细胞凋亡的重要调节因子。作为E2F家族的重要成员，E2F2的异常表达总与各种癌症的不良预后高度相关，例如，E2F2水平在晚期肝细胞癌中普遍上调，E2F2高表达的患者生存率普遍较低，这表明E2F2具有成为抗癌靶标的潜在价值。因此，选择性抑制E2F2功能的潜在治疗策略的发现引起了广泛关注。然而E2F2 作为转录因子，缺乏典型的配体结合域，传统上被认为是“不可成药”的靶点。分子胶是一类小分子，可以诱导蛋白质-蛋白质相互作用，以驱动以前不可成药的蛋白质降解。但到目前为止，仍未见有关具有选择性 E2F2 靶向特性的分子胶的报道。
为了探索 E2F2 降解策略，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞与曾克武团队使用中药蟾酥主要活性蟾毒灵（Bufalin，BF）作为化学探针来确定其在肝细胞癌 (HCC) 中的药理作用。结果表明，一种新的非典型E3连接酶ZFP91可作为降解E2F2转录因子的药物靶点。此外，实验发现蟾毒灵具有分子胶的功能，可以有效诱导转录因子E2F2与非典型泛素连接酶ZFP91形成E2F2-ZFP91-蟾毒灵三聚体复合物，进而促进E2F2的泛素化和蛋白酶体途径降解。
此文章于2022年11月发表在eBioMedicin：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104353
MST微量热泳动技术
在这项研究中，NanoTemper的微量热泳动MST分子互作技术被用于检测蟾毒灵作为分子胶水分别与E2F2和ZFP91的亲和力（图1）。
MST技术可以在细胞裂解液中检测目的蛋白和另外分子的互作，即可免纯化。对于难纯化的蛋白来说，仍可完成定量亲和力的检测。
该研究中在裂解液中目的蛋白通过2种不同的方法带上荧光，完成复杂环境中目的蛋白与其他分子的准确亲和力测定。
在检测E2F2与蟾毒灵互作时，构建了带有his-tag标签E2F2质粒，在HEK293T细胞中过表达。裂解后，使用NanoTemper RED Tris-NTA试剂盒特异性标记裂解液中his-tag E2F2，使其带上荧光，然后向裂解液中加入梯度稀释的蟾毒灵。微量热泳动 (MST) 实验表明，蟾毒灵直接与E2F2结合，解离常数为3.15 ± 1.43 μM（图2）。
在检测蟾毒灵与ZFP91互作时，作者构建pEGFP-N1-ZFP91质粒转染导HEK293T细胞中过表达，裂解后取上清，将上清液中的EGFP-ZFP91直接作为荧光信号源，加入梯度稀释的蟾毒灵。MST测定显示蟾毒灵以 462 ± 146 nM的解离常数（Kd）与ZFP91结合（图3）。
蟾毒灵可拆分成α-吡喃酮（α-Pyr）与DHA两个结构，团队通过MST实验证明α-Pyr直接与ZFP91蛋白结合（Kd = 900 ± 322 nM），但不与ZFP91的C349A突变结合（Kd未检测到）（图4），表明α-Pyr是蟾毒灵与ZFP91发生结合的关键基团。综合其他结果，团队提出蟾毒灵可以作为分子胶介导E2F2-ZFP91复合物的形成，进一步促进E2F2的泛素化和降解。
总的来说，这项研究进行了基于分子胶的E2F2癌症治疗靶向策略的概念验证，在癌症治疗中具有广阔的药用价值。同时，该研究还揭示了蟾毒灵作为天然“分子胶水”发挥抗肿瘤作用的独特药理机制，也为抗肿瘤药物的设计提供了具有中医药特色的新颖靶点与先导药物分子。
Monolith 分子互作仪
在此项研究中，MST技术为蛋白质-蛋白质、蛋白质-酶之间的亲和力检测提供了可靠的数据，并且可免纯化定量检测裂解液中目的蛋白和其他分子的互作强度，标记方法灵活，大大加快了实验进展。基于MST技术的Monolith系列分子互作仪，不依赖于分子量的改变，蛋白用量少，对于蛋白聚集耐受度高，可以轻松表征不同类型的分子间相互作用。
关注NanoTemper，获取更多资讯
座机｜+86 10 8446 2100
官网｜nanotempertech.com/zh_cn