题目：Landmarks of human embryonic development inscribed in somatic mutations
中文：人类胚胎发育的体细胞突变图谱
细胞谱系信息是了解有机体发育的基础，但人类可获得的直接用于注释细胞谱系的信息却很少。单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法已被用于分析细胞发育过程中的转录变化，但它们不足以用于谱系追踪，使得整体的发育谱系模式仍在很大程度上未被探索。本研究以人类细胞发育为对象，研究个身体的发育祖细胞和细胞克隆组成，作者描述了体细胞单核苷酸变体（sSNV），并认为它们适合作为谱系标记，因为它们随着每个细胞分裂而积累，并且大多数突变被预测为功能沉默。
全基因组测序（WGS）：对一名17岁且死于无医学诊断的男性（ID:UMB1465）的5个样本DNA进行了＞250X的检测。同时，对PFC和另外两名同样死于无医学诊断的患者（15岁女性（ID:UMB4638）和42岁女性（ID:UMB4643））的两个视觉皮层样本也进行了>250×WGS。使用机器学习算法分析数据，并与以前发表的单细胞WGS相结合，共识别出516个sSNV。在UMB1465样本中检测到的297个sSNV中，65个（22%）存在于所有组织中，181个（61%）存在于至少两个组织中。所有65个广泛共享的sSNV显示交替等位基因频率（AAF）>1%，其中38个（58%）显示>3%。灵敏度分析表明：作者的方法实现了近100%的灵敏度检测sSNV的3至30%AAF。大多数sSNV在功能上是中性的，因此代表无偏的谱系标记。克隆的sSNV在所有器官中表现出相似的碱基替换模式，其中55%是C>T替换。三核苷酸的背景类似于在增殖组织和癌症中看到的sSNV，这可能反映了循环细胞中胞嘧啶脱氨的错误修复。肝脏特异性变异体比心脏或大脑特异性变异体更常见（分别为n=57、33和19），与已知的克隆扩增模式和常驻干细胞肝脏单位的替换模式一致，而脾脏特异性变异体最不常见。对来自17个组织的94个样本进行基于扩增子的靶向测序（平均约25000×次），发现大多数SSNV（>93%），而对WGS进行相同的活检；当对不同的组织活检进行分析（81%）时，发现的数量略少，总的来说，229个靶向变异体中有196个（86%）得到了验证。
来自UMB1465的20个单个神经元的单细胞WGS数据将297个sSNV中的82个定义为分支或克隆，产生了一个跨越早期合子后细胞世代的谱系树，并将每个突变的起源追溯到胚胎。正如所料，早期sSNV表现出较高的镶嵌分数（MFs），即携带该变异体的细胞分数，常染色体SNV定义为2×Bluk AAF，子分支的MFs与母克隆的MFs相加。基于大量WGS和单细胞分析，在另外两个个体中也发现了类似的早期谱系模式。在UMB1465中，我们鉴定了与第三代细胞相对应的前8个合子后祖细胞，其中c1到c8的MFs和≈100%，表明所有主要的早期血统都被捕获；然后作者追踪它们对每个器官的相对贡献。各器官对c1和c8的贡献极不相同，心脏和脾脏中未检测到c4，c3和c8共同贡献了细胞含量的50%以上。
细胞世代间MFs的变化表明，在胚胎和胚外组织之间以及胚胎内的几个生殖层中，早期祖细胞的分离高度不对称。在细胞分裂过程中，观察到一个分支（c8）的MFs几乎没有减少，而不是预期的两倍减少；在其他分支和另外两个个体中也观察到两倍减少的偏差。这种模式表明，当胚外组织与胚胎组织谱系分离时，囊胚形成过程中克隆分配不均。所观察到的MF不对称性表明，人类胚胎中的谱系分离可能早在小鼠的两细胞期就发生了。为了进一步验证这个假设，作者分析了74个个体的WGS数据（250×）。结果表明，第一代细胞克隆对人体的总体不对称贡献具有很强的个体间变异性，从某些个体的50:50对称性到20:80不对称性，甚至可能更高。
单核RNA-seq（snRNA-seq）和转座酶可及染色质测序的单核数据分析（snATAC-seq）揭示了细胞类型的分类，但这些簇也可能与基因型有关。尽管受到单细胞覆盖稀疏性的限制，snATAC-seq的读取与snRNA-seq的读取相比在整个基因组中分布更均匀，这表明snATAC-seq可能更适合于检测全基因组的sSNVs。在297个sSNV位点，5.6%的snRNA-seq细胞（34325个中的1933个）和12.8%的snATAC-seq细胞（65199个中的8356个）在297个sSNV位点中至少有一个获得了覆盖。为了将细胞谱系信息与细胞类型联系起来，作者将所有约100000个细胞分为7组，并用图S2A中至少一个谱系标记检查细胞。尽管c8对不同细胞类型的贡献出现了一些趋势，但迟发变异的稀疏覆盖通常阻止了这种方法对谱系分化的观察。作者的数据指出了结合高通量DNA和RNA分析的新方法的潜力，以系统地分析人类不同细胞类型的形成。
作者的分析表明：在几个合子后细胞分裂过程中出现的数百个sSNV标志着人类胚胎发育的标志，并为器官和组织内及组织间的克隆分布模式提供信息。虽然外周血DNA分析表明早期合子后克隆对胚胎组织的贡献是不对称的，但我们在这里展示了原肠胚形成和器官发生过程中后期克隆增殖的顺序不对称性和变异性。MFs的高器官内波动突出了所有检查组织内和跨所有组织的随机克隆模式。作者发现：由大脑特异性祖细胞产生的克隆在整个大脑皮层的平均MFs<2.2%，这就强调了单细胞测序的必要性。sSNV对额叶的区域限制在更低的MFs中可见(≤0.6%)。观察到的原始克隆的分散性与先前的估计一致，即人类大脑皮层的一个特定区域是由~10个特定的祖细胞形成的，这些祖细胞形成兴奋性神经元，广泛地混合在大脑皮层的广泛区域。鉴于与体细胞突变相关的条件越来越多，对这里描述的细胞谱系模式以及功能信息的更深入理解将有助于阐明这些疾病中嵌合体的起源和后果。
伯豪生物提供snRNA-seq及snATAC-seq服务，且现有商业化细胞核分离试剂盒在售，该款试剂盒适用于绝大多数的临床组织样本及动物模型样本。详情咨询：17702139967（微信同号）
本产品适用于人或动物新鲜及冻存组织样本的细胞核分离提取。通过裂解细胞膜，释放细胞核的同时保持细胞核膜的稳定，经密度梯度离心去除裂解后的组织碎片和杂质，避免细胞质的污染。优化的细胞核重悬液能够有效维持细胞核膜的完整和染色质的空间结构稳定。