期刊：（IF：15.266）
技术：scRNA-seq、snRNA-seq
导读
肝细胞癌（HCC）是一种常见的原发性肝癌，总生存率低。将非酒精性脂肪肝相关HCC患者的肝癌肿瘤和癌旁组织中生成的肝脏snRNA-seq数据、包括病毒和非病毒来源的癌组织、癌旁组织和正常肝脏样本的肝脏scRNA-seq数据和TCGA数据库和肝癌研究所(LCI)的癌组织和癌旁组织的bulk RNA-seq数据进行联系分析来寻找HCC中的细胞类型差异。联合分析发现增殖性Prol细胞在肿瘤中显著富集，然后对TCGA和LCI的数据解卷积，发现8种细胞类型只有Prol显著增加，为了确定该细胞类型对生存预后的临床意义，通过COX回归发现高Prol细胞类型占比与较差的生存结果相关。肿瘤抑制基因TP53和RB1的体细胞突变与HCC中Prol细胞类型的增加有关。为深入了解HCC相互依赖的生物学机制提供依据。
结果
1. snRNA-seq和scRNA-seq数据整合分析
综合数据进行聚类，鉴定出25个细胞亚群，再根据谱系将这些划分为8个主要细胞类型。在肿瘤样本中一个新的细胞类型显著富集(80.4%)，将其命名为增殖(Prol)细胞亚型。基于marker基因进行GSEA分析并对25个细胞亚群进行功能注释，发现Prol的功能可能与生长和细胞分裂有关。为了进一步研究Prol的增殖能力，根据G2M和S细胞周期基因的平均表达量对Prol进行G2M和S模块评分。来自Prol的细胞/细胞核显示出显著较高的S期和G2M期模块评分。较高的细胞周期评分意味着Prol由活跃分裂的细胞组成。从Prol细胞的656个差异表达基因中筛选了15个差异倍数最高的Marker基因。其中12个曾在HCC发病机制中被证实或与该病的临床特征相关。单细胞水平数据分析显示Prol细胞类型与HCC相关。
2. bulk RNA-seq数据验证
根据现有的TCGA和LCI获取的bulk RNA-seq数据，评估单细胞鉴定出的8 种主要cluster和25种亚群的细胞类型比例。在TCGA中搜索配对的HCC肿瘤和非肿瘤组织之间这8种细胞类型的丰度差异，结果显示Prol是HCC肿瘤中唯一持续上调的细胞类型，与单细胞水平分析结果一致。marker基因表达分析进一步确认了Prol的marker基因在整体HCC组织水平显著增加。
3. Prol细胞集群与HCC的生存分析
为了确定Prol 细胞类型在TCGA上的临床相关性，对TCGA和LCI数据库中Prol对361例HCC患者总生存期（OS）和无进展间隔（PFI）的影响进行评估。根据中位数将 HCC患者分为低细胞型和高细胞型比例组，并根据年龄、性别和种族进行单因素Cox分析以及在基因水平验证基于细胞比例的结果。结果显示，较高的Prol细胞类型比例与较差的生存结果相关，并且在 HCC 肿瘤侵袭性中起关键作用。肿瘤Prol细胞类型以及高表达基因和生存率之间的负相关在独立的HCC队列中是稳健和可重复的。
4. 体细胞TP53突变与HCC中Prol细胞类型比例增加有关
TP53突变与肝癌的免疫微环境密切相关。对发现的69个显著突变基因进行了细胞类型与突变的关联分析，发现Prol是TP53或RB1突变个体中唯一显著增加的细胞，TP53错义、移码和无义突变导致Prol比例显著较高。Prol细胞/核的TP53突变评分也显著高于其他细胞/核。表明这些肿瘤抑制基因的突变与HCC中与肿瘤相关的Prol细胞类型的扩增有关。不同的体细胞突变可导致肿瘤细胞类型扩增，并突出了TP53突变在增殖和不受控制的细胞生长中的作用。
利用全面的单细胞水平数据进行分析，发现新的Prol细胞类型在HCC中的重要作用。组织特异性和癌症相关细胞类型的检测可以促进对肿瘤生物学的理解，在前瞻性验证研究中具有发现生物标志物的巨大潜力。
参考文献：