影响因子：12.121
期刊年卷：Nat Commun 2020 Jun 05
技术服务：转录组；olink
导语
在视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)和TH17诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(TH17-EAE)中，I型干扰素(IFN-I)和辅助性T细胞17 (TH17)驱动病理学。这与的理论IFN-1抑制TH17功能是相矛盾的。在这里，我们报道了IFN-I、IL-6和B细胞的级联反应促进了TH17介导的神经自身免疫。在NMOSD中，升高的IFN-I信号、IL-6和IL-17与严重残疾相关。此外，在接受抗CD20治疗的患者中，IL-6和IL-17水平较低。在小鼠中，IFN-I升高IL-6并加剧TH17-EAE。引人注目的是，IL-6阻断仅在用IFN-I治疗的小鼠中减轻疾病。相反，在有或没有IFN-I治疗的情况下，B细胞缺乏减弱TH17-EAE。最后，IFN-I刺激B细胞产生IL-6，驱动体外致病性TH17分化。因此，我们的数据为神经自身免疫中IFN-I和TH17的悖论提供了一个解释，并可能有助于预测NMOSD的治疗反应。
研究结果
1.根据转录组数据基于IFN-I信号对NMOSD进行分类
作者进行了全血RNASeq以确定与健康对照相比与NMOSD疾病相关的转录特征。在NMOSD患者队列中，62%的患者接受利妥昔单抗治疗，21%的患者接受非B细胞去除治疗，17%的患者在抽血时未接受疾病缓解治疗。利妥昔单抗治疗的患者会使我们对差异表达基因(deg)的分析偏向于受B细胞耗竭影响的基因，而远离与NMOSD病因学相关的基因。事实上，当与健康对照组比较时，发现利妥昔单抗治疗的NMOSD(NMO-Ritux)患者与未接受利妥昔单抗治疗的NMOSD患者NMO-Other Tx)或未接受治疗的NMOSD患者(NMO-Untreated)相比，有更多的基因下调(图1a–c)。为了确定与治疗无关的NMOSD相关的基因表达特征，我们确定了NMO-Ritux，NMO-Other Tx，NMO-Untreated共有的deg。共有27个deg(图1d)。27个共有的DE基因中有25个是IFN-I诱导型基因(图1d)。发现25种IFN-I基因聚类将NMOSD患者分为两个不同的亚组，即高IFN-I标记(IFN-high)患者和低IFN-标记(IFN-low)患者(图1e)。接受利妥昔单抗治疗的患者、接受其他治疗的患者和未接受治疗的患者同时出现在高干扰素组和低干扰素组(图1e)。
使用olink来评估与健康志愿者相比，干扰素高的患者和干扰素低的患者中91种炎症蛋白的水平。IFN-high NMOSD患者26种炎症蛋白显著升高与健康对照组相比(p < 0.05且Log2FC > 0.5)。相比之下， IFN-low NMOSD患者中只有三种蛋白升高(图1f)。IFN-I诱导的趋化因子(CXCL9，CXCL10，CXCL11，MCP-3/CCL7)在IFN-高的患者中升高，而在IFN-低的患者中不升高。作者还发现，IL-17A（原型TH17细胞因子）和CCL20（一种促进TH17进入炎症组织的趋化因子），在IFN高的患者中升高，而在IFN低的患者中不升高。最后，作者观察到IL-6是干扰素水平高的患者中升高最多的蛋白之一(图1f)。这些数据表明，高IFN-I患者还表现出血清IL-6和TH17途径相关蛋白水平升高。
2. 血液标记物与NMOSD中的残疾相关
研究了IFN-I转录信号是否与NMOSD患者的临床特征相关。引人注目的是，我们发现IFN-高NMOSD患者在扩展残疾状态量表(EDSS)中的得分显著高于IFN-低NMOSD患者(图1g)。然而，两组在复发率、年龄和抗AQP4或MOG抗原的自身抗体状态方面没有差异(图1h–j)。作者评估了血清蛋白对基于EDSS的患者分层的效用。发现与EDSS评分低的患者相比，EDSS评分高的患者MCP-3和IL-6显著升高(图1k,l)。此外，还评估了PBMCs中特定的效应T辅助细胞亚群是否与残疾相关。为此，我们从未经治疗的NMOSD患者队列中收集了PBMC样本并确定TH17细胞(CXCR3–CCR6+CD161+)，TH17.1细胞(CXCR3+CCR6+CD161+)，或TH1细胞(CXCR3+CCR6−CD161−)与EDSS有关联。我们发现TH17和TH17.1与EDSS之间没有明显的相关性(图2a,b)。然而，TH17和TH17.1的组合频率显示与EDSS显著正相关(图2c)。没有观察到与EDSS和TH1细胞的正相关(图2d)。此外，与健康志愿者相比，NMOSD患者中TH17细胞的百分比较高，但TH1或TH17.1细胞的百分比较低。综上所述，IFN-I、TH17和IL-6的协同作用驱动过度的CNS组织损伤，导致NMOSD的严重残疾。
3.B细胞消耗疗法在NMOSD中的作用
NMOSD的一种流行疗法是用抗CD20抗体去除B细胞。在我们的队列中，62%的患者在采集血清样本时使用利妥昔单抗。为了确定利妥昔单抗治疗的转录效应，我们比较了接受利妥昔单抗治疗的患者和未接受利妥昔单抗治疗的患者的deg。基于DEGs的表达，患者被分为两组，我们将其定义为B细胞缺乏和B细胞充足(图3a)。我们发现B细胞缺陷组的所有患者都在接受利妥昔单抗治疗。我们还发现，在B细胞充足组的18名患者中，有14名没有接受利妥昔单抗或其他B细胞去除疗法(图3a)。基于群体中相似的表达模式，DEGs被分成四个基因簇(图3a，b)。为了确定B细胞缺失是否影响NMOSD患者的IFN-I信号，我们评估了IFN-高和IFN-低NMOSD患者在B细胞缺乏和B细胞充足组中的分布(图3c)。在B细胞缺乏和B细胞充足的患者中，IFN-高和IFN-低NMOSD患者的百分比相似(图3c)。这些数据表明，用利妥昔单抗治疗的B细胞去除不影响NMOSD中IFN-I基因的表达。然而，确实观察到与B细胞充足的患者相比，B细胞缺乏患者的血清蛋白谱有显著差异(图3e)。血清IL-6、IL-17和MCP-3水平在IFN-高B细胞充足的NMOSD患者中最高，而在B细胞缺乏的IFN-高组中降低(图3e)。我们还比较了NMO-Untreated，NMO-Other Tx，NMO- Ritux和健康对照组的IL-6、IL-17和MCP-3水平。血清IL-6水平在NMO-Other Tx，NMO-Untreated中升高，但在NMO-Ritux不升高；血清IL-17在NMO-Other Tx患者中升高；并且MCP-3在NMO-Untreated患者中升高(图3f)。这些数据表明，在NMOSD患者中，B细胞是升高IL-6、IL-17和MCP-3的关键细胞类型。
4. IFN-I在人记忆B细胞中促进IL-6的表达
B细胞是NMOSD中IL-6的主要产生者。接下来验证IFN-I是否驱动B细胞中IL-6的表达。在B细胞充足的NMOSD中，我们发现IL-6和IFN评分之间以及IL-6和CXCL11蛋白之间存在显著的正相关(图5a)。相反，在B细胞缺陷的NMOSD患者中，IL-6和IFN评分之间或IL-6和CXCL11之间没有相关性(图5a)。在健康对照中，在IL-6和IFN评分之间没有观察到相关性，但是在IL-6和CXCL11蛋白之间有显著相关性(图5a)。总之，这些相关性表明IL-6是由B细胞中的IFN-I诱导的。为了直接检验这个假设，我们从健康供体的外周血母细胞中分离出CD27−幼稚和CD27+记忆B细胞。在IFN-β存在或不存在的情况下，两种B细胞亚群都通过CD40和B细胞受体被激活。IFN-β刺激没有改变初始B细胞中CD80和CD86的表达，但显著增加了它们在记忆B细胞中的表达(图5b,c)。IFN-β刺激没有改变幼稚B细胞的IL-6表达，但显著增加了记忆B细胞的IL-6表达(图5 b,c)。因此表明，IFN-I驱动记忆B细胞在NMOSD中产生高水平的IL-6。
5.动物模型验证假设
动物模型是必要的，以确定疾病的机制。在TH17-EAE我们以前发现IFN-β治疗对TH17-EAE无效，反而会加重疾病。然而，这种情况发生的机制还不清楚。与我们之前的观察一致，IFN-β加重了瘫痪(图6a)并增加了TH17-EAE小鼠脊髓中免疫细胞的浸润和脊髓脱髓鞘 (图6b)。由于IFN-I信号和血清IL-6与NMOSD患者疾病负担增加相关(图1g,l)，作者测试了在TH17-EAE小鼠中，IFN-β治疗是否提高了IL-6。发现IFN-β治疗显著提高了血清IL-6水平(图6c)。此外，还发现在IFN-β治疗的小鼠脊髓中T辅助细胞的数量增加(图6d)。在用IFN-β治疗的TH17-EAE小鼠的CNS中，共表达IL-17和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的T-helper细胞也增加了(图6e)。发现IFN-β治疗没有改变TH17-EAE小鼠中枢神经系统中B细胞的数量(图6f)。数据表明，用IFN-I治疗TH17诱导的疾病与高水平的IL-6和增加的中枢神经系统浸润性炎症TH17细胞数量有关。
据报道阻断IL-6对TH17-EAE几乎没有影响。我们观察到IFN-β治疗诱导更高水平的IL-6，因此我们假设阻断IL-6将改善用IFN-β治疗的TH17-EAE小鼠的疾病。为了解决我们的假设，用IFN-β或载体以及拮抗的抗IL-6R抗体或同型对照治疗TH17-EAE小鼠。我们发现抗IL-6R治疗并不能改善载体治疗小鼠的TH17-EAE(图7a)。与载体治疗小鼠的临床过程一致，我们发现分泌GM-CSF或IL-17的辅助性T细胞的数量没有显著差异(图7b)和中性粒细胞或炎性单核细胞的数量没有差异。相反，我们发现IFN-β和抗IL-6R治疗显著减弱了TH17诱导的EAE(图7c)。在同时使用IFN-β和anti-IL-6R处理的小鼠的CNS中，GM-CSF+和IL-17+ TH细胞(图7d)和中性粒细胞数量减少。这些数据表明IFN-I在TH17-EAE中驱动IL-6的炎症功能。
在TH17-EAE期间，I型IFN如何影响B细胞的功能尚不清楚。为了解决这个问题，作者在C57BL/6小鼠和b细胞缺陷、µMT小鼠中诱导TH17-EAE，然后用载体物或IFN-β处理。与载药处理的C57BL/6小鼠相比，载药处理的µMT小鼠在TH17-EAE疾病的发病上有显著延迟(图8a)。事实上，在疾病终点，我们发现载体处理的µMT和C57BL/6小鼠脊髓中分泌GM-CSF或IL-17的T辅助细胞数量没有显著差异(图8b)。与C57BL/6小鼠相比，IFN-β处理的µMT小鼠在整个疾病过程中疾病严重程度显著减弱(图8c)。与IFN-β处理小鼠的病程一致，µMT小鼠脊髓中表达GM-CSF或IL-17的T辅助细胞数量显著减少(图8d)。总之，这些发现表明，B细胞缺乏可降低TH17-EAE疾病的严重程度，无论是否使用IFN-I治疗。此外，与载体治疗的小鼠相比，IFN-I-treated的小鼠对B细胞缺乏的疾病保护时间更长。
参考文献：