标题：Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma
期刊：Cell research（IF= 25.617）
技术：ScRNA_Seq
导语
胰导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是最常见的胰腺癌类型，其特点是肿瘤内高度异质性和不良预后。为了全面描述PDAC肿瘤内异质性及其潜在原因，本研究利用单细胞RNA-seq (scRNA-seq)从原发性PDAC肿瘤和对照胰腺中获得了57,530个胰腺细胞的转录组图谱，并鉴定出不同的恶性细胞和间质细胞类型，包括两个导管亚型，分别具有异常和恶性基因表达谱。细胞轨迹分析显示，多种肿瘤相关通路和转录因子(tf)的成分在PDAC进展过程中有差异表达。此外，我们还发现一组导管细胞具有独特的增殖能力，这些特征与肿瘤浸润T细胞的失活状态相关，为预测癌症提供了新的标志物抗肿瘤免疫反应。
研究结果
1. PDAC肿瘤和对照样本的单细胞表达图谱和细胞分型
为了探索PDAC的细胞多样性，本研究从24个PDAC肿瘤样本和11个未经任何治疗的对照胰腺中生成了单细胞RNA-seq图谱，经过最初的质量控制，我们获得了来自PDAC样本的41,986个细胞和来自对照胰腺的15,544个细胞的单细胞转录组。为了探索肿瘤的细胞组成，我们对所有细胞中可变表达的基因进行了主成分分析，并确定了10个主要簇，包括1型导管细胞，2型导管细胞，腺泡细胞，内分泌细胞，内皮细胞，成纤维细胞，星状细胞，巨噬细胞，T和B细胞（图1b,c）。接下来展示了每种细胞类型定义用的marker基因。
2. CNV图谱鉴别PDACs中恶性导管细胞
研究发现，PDAC中存在两种不同类型的导管细胞，本研究通过CNV定义两种导管细胞的恶性程度，发现2型导管细胞中CNV水平明显高于1型导管细胞和其他类型细胞（图2a,b）。接下来鉴定了两种导管细胞中基因表达的差异，发现了3107个差异表达基因（图2c）。通过对差异基因进行富集发现，2型导管细胞中富集到的功能主要与癌症相关，比如：细胞增殖、侵袭和迁移。相反，在1型导管细胞中富集到的功能主要与正常胰腺功能相关，包括消化、胰腺分泌和碳酸氢盐转运（图2d），进一步证实了2型导管细胞恶性程度高于1型导管细胞。接下来研究了异常导管细胞和恶行导管细胞marker基因（AMBP，FXYD2,MUC1,FXYD3）的表达谱，并通过IHC进行了验证(图2e、f)。综上所述这些结果表明2型导管细胞是PDACs中恶性细胞的主要来源。
3. 导管细胞恶性进程
研究发现1型导管细胞可被分为2种细胞类型，其中Subgroup1中AMBP高表达，MUC1低表达，Subgroup2中AMBP低表达，MUC1高表达。另外通过功能分析发现Subgroup2中的功能与肿瘤相关，认为相比于Subgroup1，Subgroup2中恶性程度更高（图S3a,b,c）。接下来对导管1型细胞和导管2型细胞进行拟时序分析，同时分析了PDAC进展轨迹中所有基因的基因表达模式，鉴定出2299个基因基因具有动态表达变化。对基因表达模式进行聚类发现P1-P4与非正常细胞类型相关，P5-8与恶性肿瘤细胞相关。同时对相应的Cluster的基因集进行了功能富集（图3a-d）。功能富集分析显示胰腺细胞功能正常的基因，如消化、翻译、氧化磷酸化等，在基因表达谱异常的导管细胞中表达水平较高，在向恶性转化时下调。相反，我们发现了多个经典的致癌通路，包括ErbB和Notch信号通路，在PDAC进展过程中被激活。特别是，在肿瘤进展的后期，大量负责细胞增殖和迁移的基因被显著激活。
4. 基于恶性导管标记的TCGA PAAD样本基因表达模式分析
接下来，分析了来自TCGA (https://cancergenome.nih.gov/)的浸润性胰腺导管腺癌及其变种(PAAD)数据，以研究恶性导管细胞中基因表达模式的临床价值，包括癌症表达数据、临床信息和基因组突变数据。本次分析共使用了178个PAAD样本(146个PDAC样本，32个非PDAC PAAD样本)。恶性导管细胞标记物用于聚类PAAD肿瘤样本，结果表明，根据这些标记，所有样本可分为3个PDAC组(聚类1-3)和1个非PDAC组(聚类4)（图4a-b）。接下来探讨了增殖性导管标记物在PDAC患者中的预后价值，采用无监督非负矩阵因子分解(NNMF)聚类，根据增殖标志物的表达水平将PDAC患者分为3个亚组 (图4c)。发现组3中的患者显示出高丰度的增殖性导管标记物，同时与其他组相比存活率显著较低(图4d)。接下来，试图鉴定可药理学靶向增殖性导管细胞的药物，并发现CDK1、PLK1和AURKA可通过使用它们的特定药物作为PDAC的治疗靶点(图4e)。然后，选择了CDK1、PLK1和AURKA的抑制剂，以验证它们对胰腺癌细胞生长的抑制作用。结果证明这些抑制剂可以显著抑制细胞增殖(图4f)。
5. PDAC患者中肿瘤T细胞的激活状态
接下来我们将Group3与另外两组的TCGA转录组数据进行比较，以确定差异表达基因，Group3患者中检测到759个上调基因和946个下调基因(p.adj≤0.01，|log2FoldChange|≥0.5)（图5a）。GO功能富集分析显示，上调基因主要富集在细胞周期、DNA复制和DNA修复等，而下调的基因主要富集T细胞选择和淋巴细胞激活等（图5b）。然后研究分析了上述差异基因在我们的单细胞数据中的表达模式(图5c)。我们发现大多数基因在特定的细胞类型中高度表达。其中，许多上调基因在2型导管细胞中表达，而下调基因主要存在于巨噬细胞和T细胞中(图5c)，表明TME中同时发生导管增殖和免疫应答异常。为了评估浸润T细胞在PDACs中的功能，我们使用TCGA数据分析了PDAC基质中的T细胞激活状态。我们观察到，增殖性导管标记物水平高的样本，相反，T细胞标记物表达水平低（图5d）。
参考文献：