上篇推文分享了这篇2022.8月发表在Nature上的一篇文章，剖析了如何从临床问题出发找到课题切入点（点击跳转上篇推文）？
此次继续关注这篇文章，剖析本文如何从RNA-seq测序数据中找到关键基因，展开后续研究？
我们先看下该文章模式图，当找到课题切入点（具体解读参考上篇推文）即STING激活剂促进Breg产生免疫抑制之后。接下来问题是，如何展开后续研究，阐明STING刺激Breg导致免疫抑制的分子机制？
为此，本研究针对STING激活剂处理与未处理的B细胞进行了RNA-seq（图a, 左侧）。通过对比，从数千个变化的基因中挑出了IL10、Ebi3和Ifna4这三个基因展示，并锁定IL10和Ebi3用于分子机制研究，通过实验最后确定是Ebi3（IL-35的亚基）介导了STING刺激导致的Breg免疫抑制。
本研究是如何从数千个差异表达基因中选定以上分子的？背后的逻辑是什么？剖析如下：
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为何RNA-seq数据要展示Ifna4?RNA-seq数据分析中展示Ifna4，是作为阳性对照。因为STING激动剂刺激细胞后，已知的经典功能是激活IFN信号（IFN相关基因上调），Ifna4作为IFN信号通路重要基因，其上调证明了该测序结果的可靠性。
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如何从数千个变化的基因中，挑选出IL10和Ebi3作为候选基因？
通过图a我们可以看到，STING激动剂处理后，B细胞中差异基因有数千个之多，本研究挑选的IL10和Ebi3看起来变化并不是最显著，那么为何会被挑选出来作为分子机制的切入点？
这里要说下组学数据中筛候选基因的两个重要依据：
a.表达差异显著性(p value or fold chage);
b.表型+已有文献研究结论+差异表达分析。
显然，本研究以后者作为筛选标准(因为IL10和Ebi3的变化差异显著性并非最显著，见图a)。结合文献中已经报道的免疫抑制性分子，再分析本RNA-seq结果中显著改变的基因，二者交集，即可选出最佳候选基因，作为后续分子机制展开的突破口。
这里之所以选择IL10，因为其是已经熟知的典型的Th2型细胞因子，发挥免疫抑制性作用；
之所以选择Ebi3，因为该基因是IL35亚基的一个编码基因，而IL35是已经报道的可以抑制NK细胞功能，发挥免疫抑制作用的。加之前期公共数据signature相关性分析也已经提示Breg可以抑制NK细胞功能（见下图），因此可以锁定IL35，同时确定Breg分泌IL35后通过抑制NK细胞功能发挥免疫抑制作用，通过这些数据，进一步完善本研究的最重要科学假说，即STING激活剂作用于B细胞，促进Breg增多，分泌IL35，抑制NK细胞功能，最终导致免疫抑制，STING治疗失效。
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如何最终排除IL10，锁定Ebi3？
为证实IL10和IL35最终是哪个分子发挥作用，这里进行了抗体中和回补实验（rescue），实验结果表明，只有IL35抗体处理可以减少STING激活剂对B细胞增多的表型（下图a），且解除对NK的抑制（下图b）。
小结
通过以上剖析，我们可知组学数据中确定候选基因/靶标常用的两种思路，即1.表达差异显著性(p value or fold chage)+2.表型+已有文献研究结论+差异表达分析. 第一种思路根据数据分析结果即可筛选出来，但是第二种思路往往需要做大量的文献调研及关联思考方可选定。具体来说，第二种思路需要根据表型结果，通过文献总结，确定下来一个基因集合，然后和你的差异基因取交集。至于怎么确定这个基因集合，以本文为例，表型是免疫抑制表型，那么可以通过文献汇总报道过的免疫抑制分子，常见的方法是，可以找综述，很多综述都有总结，找几篇最新的综述，基本可以定下来。
本期思路剖析希望可以帮到对组学数据不知如何入手的同学，如果觉得有收获，欢迎点赞、关注支持一下，后续将分享更多案例！