WB（Western Blot）实验是一种检测特定蛋白质在样本中表达的实验方法。在进行WB实验时，要跑出完美的WB条带，制备样本要过关，因为它直接影响到实验结果的准确性和可重复性，以及条带的颜值。下面是关于WB实验样本制备的一些详细步骤：
1. **组织样本处理**：
– 取适量组织样本，用预冷的PBS或生理盐水清洗干净，去除血液和杂质。
– 使用剪刀和镊子将组织剪成小块，然后转移到匀浆器中。
– 根据实验需求，可以加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白质降解和修饰。
-组织样品推荐的取样顺序：最先取消化系统相关的组织（如胃、大小肠、肝脏、胰腺等）和富含巨噬细胞的组织（如肺)，然后取生殖相关的组织（如卵巢、子宫、睾丸等），最后取心、脾、肾、脑等器官。取下的组织如不马上使用，需冻存在液氮或-80 度冰箱里。
-对于组织一般每100mg组织加入1-2ml抽提试剂。
2. **细胞样本处理**：
– 对于贴壁细胞，先用PBS清洗两遍，然后加入适量的蛋白裂解液，通常需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
– 对于悬浮细胞，直接离心收集细胞沉淀，然后用PBS重悬并再次离心，最后加入蛋白裂解液。
-一般细胞6孔板每孔加入100-200μl抽提试剂。
3. **蛋白提取**：
– 向样本中加入适量的蛋白裂解液，使其充分接触细胞或组织。
– 使用匀浆器或超声破碎仪进行充分裂解，然后将样本转移到离心管中。
– 在4℃下，以12000g离心15-20分钟，收集上清液即为所需的蛋白样本。
4. **蛋白定量**：
– 使用BCA、Bradford或Lowry等方法对提取的蛋白进行定量，以确保每个样本中的蛋白浓度一致。
– 根据实验设计，将样本稀释到相同的浓度，通常使用裂解液进行稀释。
5. **蛋白变性**：
– 将样本与适量的5x或6x SDS-PAGE上样缓冲液混合，使最终浓度为1x。
– 在95-100℃下煮沸5-10分钟，使蛋白质完全变性。
– 冷却至室温后，即可用于SDS-PAGE电泳。
6. **注意事项**：
– 在整个过程中，要保持低温操作，避免蛋白质降解。
– 根据实验需求，选择合适的蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂。
– 确保样本充分裂解，以提高蛋白质的提取效率。
– 在蛋白定量时，要确保标准曲线的准确性，以保证实验结果的可靠性。
总之，WB实验样本制备涉及多个步骤，每个步骤都需要仔细操作，以确保实验结果的准确性和可重复性。