瑞典卡罗林斯卡学院的研究人员对稳态（健康状态）和黏膜愈合状态下的小鼠结肠空间转录组进行了深入分析，通过像“瑞士卷”一样卷起结肠的空间组新颖应用方式，首次绘制了健康和受伤后恢复状态下小鼠整个肠道的基因表达图谱，揭示了单个基因在组织中的表达位置。此文章于2022年2月发表在Nature Communications上，以下是文章的详细解读。
文章题目：The Spatial Transcriptomic Landscape of the Healing Mouse Intestine Following Damage
发表时间：2022-02-11
发表期刊：Nature Communications
主要研究团队：瑞典卡罗林斯卡学院、分子医学中心、KTH皇家理工学院研究团队等
影响因子：14.919
DOI：10.1038/s41467-022-28497-0
研究背景
肠道屏障由复杂的细胞网络组成，具有高度分隔和专门化结构。肠道依靠肠上皮的不断再生来维持体内平衡。再生途径的破坏可能导致病原体易位和慢性肠道疾病的发展，例如炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）。因此，肠道屏障必须迅速适应以促进组织再生和损伤后的愈合。然而，稳态条件下的细胞和分子电路以及它如何适应挑战尚未完全表征。
研究策略
研究人员使用Visium平台处理小鼠冷冻结肠，以进行空间转录组（spatial transcriptomics，ST）分析（图1a）。预过滤的ST数据集主要对应于蛋白质编码基因。在过滤掉非编码RNA（ncRNA）和线粒体蛋白编码基因后，得到的数据集由2,604个单独的点组成，每个点平均有4,125个基因和11,801个独特的转录本。
最近的研究表明，到14 d时，肠屏障完整性在葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）引起的损伤后得到恢复。因此，研究人员在饮用水中用DSS处理野生型（WT）小鼠7 d，然后恢复7 d，并取14 d结肠组织，通过像冷冻“瑞士卷”（frozen Swiss-rolls）一样卷起以处理ST。14 d ST数据集由3,630个单独的点组成，每个点有许多独特的基因（nFeature_RNA），与0 d组织切片相当。
通过比较稳态和黏膜愈合（来自DSS治疗的小鼠）结肠组织的ST，分析组织修复过程、免疫细胞激活/募集、促再生通路和组织重塑的转录特征，并利用与人类IBD患者疾病结果相关基因的靶向定位和全基因组关联研究（GWAS），分析IBD的风险变异及特异性病理过程。
研究成果
1. 空间转录组揭示稳态条件下小鼠结肠上皮的不同分子区域化
首先，研究人员使用非负矩阵分解（non-negative matrix factorization，NNMF）对空间转录组数据集进行反卷积以推断活性图，并将分析限制在仅捕获稳态条件下（0 d）结肠最基本结构的三个因素（图1b）。研究人员确定了3个在组织学上可分辨的、基本的结构转录组学景观，分别为肠上皮细胞（intestinal epithelial cells, IEC）（NNMF_3）、固有层（lamina propria, LP）和IEC（NNMF_2）之间的混合物，以及肌肉（NNMF_1） ，但它们与最远端结肠IEC无法区分（图1b）。为了客观地识别在结肠特定区室中差异表达的基因，研究人员使用NNMF方法来区分数据的相关变异来源。原始结肠的详细因子分析（用“n”表示）导致更明显/明显的结肠区室化，其中定义因子的顶级基因足以明确划分结肠中的区域化。特别是，这些因素定义了近端-远端和浆膜-腔轴（图1h）。使用定义近端和远端结肠IEC的因素的主要贡献基因进行功能富集分析，发现小鼠近端结肠专门用于吸水，而远端结肠专门用于溶质转运。
总之，ST能够在稳态结肠中识别以前未被重视的结肠分子区域化水平。
2. 初生小鼠结肠中ILF、B细胞相关和肠神经系统特征的识别和区域分布
接下来，研究人员检查了数据集解析组织内的宏观结构（例如淋巴簇）的能力，观察到B细胞相关基因在因子1n、3n和9n中的富集（图2a）。将这些因子映射到结肠组织后，观察到因子1n和3n定义了类似于淋巴聚集体的结构，称为孤立淋巴滤泡 （isolated lymphoid follicles, ILF）和/或隐斑（cryptopatches, CP）（图2b），因子9n定义了结肠LP，其特征是浆细胞特征性基因（如Igha、Jchain、Igkc）的高表达（图2b）。进一步研究发现，与因子3n相关的通路提示淋巴细胞启动位点（由与淋巴细胞活化相关的过程定义），与因子9n相关的通路提示效应免疫反应位点（由与适应性免疫相关的过程定义）（图2d）。有趣的是，因子1n定义了覆盖ILF的细胞/区域，其特征在于已知募集CCR6+B细胞的Ccl20 和Il22ra2 / Il22bp等基因。因此，提示因子1n定义的结构可以作为进一步成熟为ILF（因子3n）的原基（anlagen）。
因子6n的特征在于位于肌肉区域的肠神经系统（enteric nervous system，ENS）相关基因的富集（图2e）。在排名靠前的基因中，研究人员验证了泛素C末端水解酶L1（ubiquitin C-terminal hydrolase L1, UCHL1），它在神经元中特异性表达。功能富集分析证实，因子6n定义了与ENS相关的转录组谱（图2f）。
总之，Visium数据集的分辨率允许识别已知结构（例如ENS、 ILF；图2g），为进一步研究这些区域内的特定分子电路提供了一个平台。
3. 肠黏膜愈合的分子景观
该研究团队先前研究表明，14 d时肠屏障完整性DSS引起的损伤后得到恢复。因此，研究人员在饮用水中用DSS处理WT小鼠7 d，然后恢复7 d，并取14 d结肠组织，通过像冷冻“瑞士卷”一样卷起以处理ST（图3a）。尽管恢复到生理水平（即体重增加），但DSS治疗后的结肠组织并未完全恢复到体内平衡，正如其长度减少（炎症的迹象）所证明的那样。在组织学水平上，很容易识别出大的淋巴样斑块以及整个肠道的肌肉和粘膜层。值得注意的是，远端结肠（“瑞士卷”的中心）显示出明显的变化，而近端结肠（外“瑞士卷”）似乎没有受到影响。
为了解粘膜愈合过程如何在空间上改变结肠转录组，使用统一流形近似和投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）将来自0 d和14 d的ST数据嵌入3个维度，然后将这3个维度的值重新缩放为单位立方体（范围为0~1），并用作CMYK颜色空间中的通道，为每个ST点生成特定颜色（图3b）。有趣的是，在0 d和14 d样本之间的淋巴滤泡（通过H&E染色鉴定）和近端结肠区域显示出高度相似性（即相同颜色）（图3c），表明这些结构在肠道损伤后的黏膜愈合过程中受到的转录影响较小。反之，14 d结肠的远端部分是受影响最严重的区域。
为了可视化结肠组织在不同区域的转录组织方式，研究人员使用Harmony整合了来自0 d和14 d的数据并进行了聚类分析，识别出17个不同的集群，这些集群通过使用UMA将数据嵌入到二维中来可视化（图3c）。每个簇的差异上调基因总结在热图中，显示每个簇中的顶级保守基因（图3d）。每个集群定义了组织的不同地理区域。例如，簇12指定ENS，在粘膜下层具有分散的表达，而簇0在空间上映射到近端结肠（图3e）。
总之，尽管存在保守的转录结肠区域化，但组织愈合过程是不同分子特征出现的基础，并改变了特定基因表达的分布。
4. 非负矩阵分解分析揭示黏膜愈合过程中以前未被重视的转录组区域化
为了可视化粘膜愈合过程如何改变结肠的转录组学景观，研究人员使用NNMF将0 d和14 d数据集联合反卷积为20个因子。其中，8个因子由黏膜愈合期间特定区域表达的基因定义（14 d），但不是在0 d（图4b）。由于它们非常接近且在黏膜愈合过程中显著富集，研究人员重点研究了因子5、7、14和20。分析显示，因子5描绘了一个水肿区域，该区域在组织学上以炎症为特征，位于严重损伤的上皮层下方，具有完整的隐窝架构的丢失（即因子14）。通路分析显示，因子5与涉及解剖结构发育、细胞粘附和细胞外基质组织的过程相关（图4d）。因子14的特征在于参与应激反应的基因（例如Duoxa2 和Aldh1a3）和白细胞浸润基因（例如Ly6a和Cxcl5）的表达，这是对屏障破坏和组织损伤的急性反应。因子7描述了一个由结肠炎症引起的稳态破坏而产生的上皮不稳定区域，特征在于几种角蛋白基因（如Krt13、Krt5、Krt14、Krt6a）的表达，以及涉及角化细胞分化和伤口愈合的信号通路。因子20主要定义了远端上皮细胞增生和隐窝树枝状化，表明了上皮修复。
总体而言，DSS诱导的损伤导致小鼠结肠内不同的组织病理学过程同时发生。此外，上述结果揭示了以前未被重视的组织修复的异质转录和区域景观。
5. 预测算法揭示黏膜愈合过程中信号通路特定的空间模式
PROGENy通过观察信号通路中下游基因的表达变化来估计信号通路活性，从而更准确地估计通路的活性。研究人员计算了一个相关矩阵，以了解NNMF识别的空间组织转录程序（即图4中的因子) 是否可以通过信号通路活动来解释。结果显示，第2组通路（雄激素、JAK-STAT、NFkB、TNFα、p53、缺氧和 Trail）是炎症/急性损伤反应的特征，与远端上皮受损（因子7、10、14、20）和近端上皮（因子11、19）的因子相关（图5a、b）。而通常调节促再生/组织重塑过程的第1组通路（TGFβ、Wnt、PI3K、雌激素和EGFR）与定义受损上皮下组织（因子5和17）、肌肉层相关（因子2、6 和12）和淋巴滤泡（因子9）的因子相关（图5b）。值得注意的是，在稳态条件下（0 d），MAPK 和VEGF通路沿着中远端结肠均匀活跃，而在黏膜愈合期间，它们在受损/再生区域内的活化更高（图5c）。
研究人员进一步分析了这些信号通路的空间模式。结果显示，无论分析的时间点如何，结肠内TNFα和NFkB通路的活性几乎相同，且在与损伤和ILF相关的区域中，TNFα和NFkB通路活性较高。而在没有损伤/炎症（0 d）的情况下，TNFα和NFkB通路的空间分布显示活动仅限于ILF腔边缘（图5d），表明TNF驱动ILF器官发生。相比之下，JAK-STAT通路激活显示与TNF和NFkB通路主要在受损区域（因子14）共存，但在ILF中没有（图5d）。上述表明，3种通路都可能在受损组织中发挥作用，但TNFα和NFkB通路，而不是JAK-STAT通路，都参与了ILF的形成/功能。此外，与这些信号通路不同，雄激素和雌激素通路显示出相互排斥的活动模式：在受损上皮区域观察到较高的雄激素通路活性，而较高的雌激素通路活性与肌肉层相关（图5e），表明这些途径在粘膜愈合过程中呈负调节关系。
p53通路的激活在近端-远端轴上均匀分布，但与LP和肌肉层相比，它在腔侧显示出更多的活性（图5f）。有趣的是，受损区域的p53通路活性较低。p53通路的激活会触发细胞周期停滞、衰老和凋亡，这表明p53通路活性降低的点可能在受损区域内的增殖细胞中富集。研究人员利用来自14 d结肠的肠上皮细胞的scRNA-seq数据集，并确定了增殖干细胞群（图5g）。将干细胞核心特征映射到14 d结肠ST数据集上，并将干细胞核心中得分高的spots叠加到H&E部分。分析数据表明，低p53活性允许在粘膜愈合期间识别增殖的隐窝。
总之，在空间上定位了PROGENy预测的临床相关信号通路，并确认这些信号通路在黏膜愈合过程中高度协调。
6. 人类数据集与小鼠空间转录组的整合
研究人员利用人类发育中的肠道数据集，将31个不同的上皮细胞和基质细胞映射到小鼠结肠的ST数据集上（图6a），观察人类细胞类型和小鼠ST因子之间的相关性（图6b），揭示了定义近端和远端上皮细胞的转录组学特征在小鼠和人类之间是保守的。另外，两种以趋化因子CCL21和CXCL13的表达为特征的人类基质细胞，与因子9独特且强烈相关，定义了淋巴滤泡（图6b），这与这些趋化因子在ILF发育中作用一致。有趣的是，这些基质细胞在小鼠ILF内以互补模式映射（图6c），表明这些细胞的协调作用可能决定了毛囊内免疫细胞的募集/定位。然后，研究人员分析了与S1（基质1，标记人体粘膜下结构细胞的成纤维细胞）、S1-COL6A5和S1-IFIT3人体细胞（S1的两个亚型）相关的损伤/再生区域（因子5和因子14）（图6b），并以互补的分布模式映射。
紧接着，研究人员将上述分析扩展到粘膜愈合期间的其他细胞类型（图6d），发现在黏膜愈合过程中，免疫细胞、间皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞特征在特定区域内空间上丰富。并进一步的分析了这些免疫细胞如何在ILF内异质分布（图6e）。
总之，上述结果提供了概念验证，并支持结肠组织内的空间分布原则在物种之间似乎是保守的这一概念，强调了小鼠ST是有价值的可用于探索和转化关于细胞/基因分布模式的平台。
7. 空间转录组学允许绘制与临床相关性的转录组学标签
研究人员利用DSS诱导的结肠炎模型，在急性上皮损伤和恢复阶段收集结肠组织纵向RNAseq数据集，确定了显示特征表达模式的基因组（称为模块），其中一些基因是：在损伤时下调（模块2、8、7）、在急性/炎症期上调（模块1、 3、4、9) 、在DSS结肠炎的恢复阶段上调（模块5、6）（图7a）。为了确定不同的时间调节过程（即模块）是否在组织的特定区域富集，研究人员计算了模块的基因特征和ST因子之间的相关矩阵（图7b）。分析结果表明，纵向和ST数据的整合可以成为在时间和空间上揭示与疾病相关的生物过程的有力工具。
研究人员试图研究是否可以将临床相关的患者基因特征映射到小鼠ST数据集上。为此，使用了最近识别溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）患者亚组的基因标签：UC1和UC2，通过将在UC1和UC2患者中上调的所有基因映射到结肠ST，进一步分析UC1和UC2患者之间差异表达基因的空间分布。结果显示，定义UC2患者的基因在结肠中均匀表达（0 d和14 d），但定义UC1的基因主要位于14 d的损伤/修复区域内（图7e）。进一步分析表明，UC1患者的所有主要功能类别上调，包括胶原合成、ECM分解、Wnt信号通路、细胞因子信号和先天免疫在组织损伤区域。总之，与UC2患者相比，UC1患者可能具有更高的组织损伤和溃疡。
接下来，研究人员查询了各种人类IBD风险基因在0 d和14 d结肠组织的ST谱上的表达模式。在122个被查询的基因中，有95个IBD风险基因是根据其鼠直系同源物的存在及其在ST数据集中可检测到的表达来选择的。为了确定这些变体的空间表达是否定义了组织内的“地形”模式，研究人员计算了相关矩阵。聚类分析产生3个主要的共表达簇，其中簇3具有基因之间最高的空间表达相关性，该簇内基因的功能注释揭示了与免疫细胞募集、激活和抗原呈递相关通路的富集。研究人员进一步探究了属于簇3的基因的空间分布以及哪些ST因子富含IBD风险基因，分析结果揭示了人类IBD风险基因子集的表达在空间上同时发生在小鼠结肠内。它们的特定表达模式提示，在为表现出异常免疫激活的IBD患者制定治疗策略时，结肠组织淋巴滤泡可能定义了潜在的目标区域。
总结
研究人员利用适合的“瑞士卷”方法对小鼠结肠进行空间转录组分析，这是首次实现了可视化健康和黏膜愈合时整个结肠的转录组学图谱，包括最近端和远端段。应用生物信息学工具（NNMF分析），发现了在稳态条件下结肠组织以前未被发现的分子区域化。最后，将小鼠的结肠空间转录组与人体组织的转录数据整合，描述了IBD风险基因在结肠中的空间表达谱，这有助于开发潜在的靶向治疗策略。