郑州大学医学科学院李付广教授和杨明教授研究团队针对哮喘疾病进行相关研究，研究成果发表于PNAS 杂志中，研究人员在室内尘螨(HDM)诱导的哮喘模型背景下建立了脂多糖(LPS)诱导的类固醇抗性小鼠哮喘恶化模型，然后通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)对肺部的免疫细胞进行分析，本项研究为进一步加深了解哮喘加重期间免疫图谱提供了重要参考。
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研究背景
过度的气道高反应性和炎症是哮喘的标志，而脂多糖(LPS)暴露与疾病的严重程度和类固醇耐药性有关。哮喘加重是哮喘患者住院的主要原因，引起哮喘加重的因素包括室内尘螨(HDM)、花粉、呼吸道感染、香烟烟雾和污染物。大量证据表明，肺部先天免疫反应和潜在的2型免疫微环境之间的相互作用改变了炎症后遗症并引起了哮喘加重。以糖皮质激素和β2激动剂为主的治疗方法可有效缓解2型细胞因子调控的气道炎症和由过敏原暴露诱导的哮喘，然而，越来越清楚的是，肺部异常激活的免疫反应与哮喘加重密切相关，并降低糖皮质激素治疗效果，且这种激活可能与呼吸道感染和过敏原引发的哮喘和严重哮喘的急性加重特别相关。近年来，针对哮喘的免疫疗法大大提高了治疗效果，然而，免疫治疗疗效在不同哮喘患者或亚型中并不一致。因此发现特定的生物标记物和明确特定的分子调控网络，不仅可以预测治疗效果，而且还可以阐明宿主免疫细胞之间复杂的交互作用。
主要结果
1、LPS诱导小鼠哮喘加重模型中的类固醇抗性气道高反应和气道炎症
为了研究哮喘加重期间类固醇耐药性的机制，研究者将6-8周的小鼠致敏暴露于HDM建立HDM诱导的AAD（过敏性呼吸道疾病），对照组处理生理盐水。在第20天和第22天小鼠静脉注射LPS以诱发哮喘加重，LPS给药前3小时静脉注射后又给予小鼠地塞米松治疗或PBS（图1A）。地塞米松治疗后显著抑制了HDM诱导的肺AAD特征（图1B）。而且，与HDM或LPS组相比，HDM/LPS组表现出明显加重和延长气道高反应性(AHR)、巨噬细胞浸润、中性粒细胞、黏液高分泌和炎症升高，此外，HDM/LPS组中注射LPS不影响HDM诱导的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润水平；地塞米松也未抑制HDM/LPS夸大的AHR；BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润升高（图1C）；地塞米松治疗没有降低嗜酸性粒细胞和炎症评分，只是减少气道中少量黏液产生细胞（图1D）和肺病理改变升高（图1E）。生理盐水刺激对上述哮喘特征无影响。
2、肺免疫细胞scRNA-Seq鉴定出多个免疫细胞簇
研究者对三组（生理盐水处理组(SAL)、HDM/LPS+vehicle（VEH组)和HDM/LPS+地塞米松组(DEX)），每组6个小鼠的肺组织进行流式分选小鼠肺中的CD45+细胞，并对其进行单细胞测序。每个细胞约检测到1,000个基因，共检测到超过23,000个不同的基因，其中共检测到3,139个高度可变的基因(HVGs)。通过聚类进一步分为20个细胞簇，并进行鉴定注释（图2A、B）。
3、CD11b+巨噬细胞、多个树突状细胞(DCs)亚群和ILC2可能与类固醇耐药性AHR和气道炎症有关
分析SAL组、VEH组和DEX组差异转录本，在SAL组、VEH组和DEX组中分别检测到848、1335和1379个高变基因作为标记基因（图3A），在VEH组中，诱导巨噬细胞和CD103−DC簇略有增加（图3B和C）。有趣的是，地塞米松治疗增加了细胞簇中细胞数量，包括CD4+T细胞、CD19+B细胞、中性粒细胞、三个单核细胞簇和treg，但CD11b−巨噬细胞数目有所降低，且其他细胞的数目并未受到明显影响.
4、IL-4和IL-13在嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞中均有差异表达
众所周知，多种促炎因子在哮喘和哮喘加重的发病机制中起着关键作用，因此，研究人员评估了与Th1、Th2、ILC2s、抗感染反应和气道重塑相关的经典因子的表达。在SAL、VEH和DEX三组中，几乎所有的cluster都高表达CCL5，其表达受地塞米松治疗的影响不显著。包括一些高表达量的细胞因子，如IL-4、IL-13和IFNγ等。其中，IL-4和IL-13是驱动2型反应的关键细胞因子，地塞米松治疗并没有抑制CD8−树突状细胞和嗜碱性粒细胞对IL-4的表达；相反，它促进了Ly6C+和Ly6C−单核细胞、treg和CD103−树突状细胞产生该细胞因子。IL-13在CD8+记忆T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞中有差异表达，而这种表达对糖皮质激素不敏感。地塞米松治疗可轻微促进了CD8+记忆T细胞对IL-13的表达。IFNγ在NK1.1+NK细胞、CD11b+巨噬细胞和CD8+记忆T细胞中表达，该表达具有类固醇抗性。Ly6C+和Ly6C−单核细胞和CD103−和CD8−树突状细胞表达CCL24，这是主要的嗜酸性吸引趋化因子之一。IL-1β在CD11b−巨噬细胞、CD8+记忆T细胞、CD103−和CD8−DCs中高表达，而且这种表达是对类固醇有耐药性的。IL-18的主要在Ly6C−单核细胞、CD11b+巨噬细胞和CD8−树突状细胞中高表达。IL-10主要在Ly6C−单核细胞、CD11b+巨噬细胞、CD103−树突状细胞和CD8−树突状细胞中表达。treg也表达IL-10，但表达水平明显较低。IL-1α、IL-2、IL-6、IL-12a、CCL2、TNF、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3在免疫细胞中也有差异表达。但在SAL、VEH和DEX组中未检测到IL-3、IL-5、IL-5、IL-17a、IL-25、IL-33和TSLP的表达（图4a）。使用Cytoscape的ClueGO插件进行GO分析，以显示上述细胞因子和趋化因子的过度功能类别（图4b）。结果显示显著富集的基因参与了白细胞分化的正向调控、STAT蛋白酪氨酸磷酸化的正向调控等，而且，中性粒细胞迁移和脂多糖介导的信号通路也被确定。
5、IL-13调控HDM/LPS诱导的类固醇耐药性AHR和气道炎症
IL-13已被证明在过敏性气道疾病的发病机制中起着核心作用。研究者使用IL-13-tdtomato-reporter小鼠来确定细胞来源，CD8+T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞被证实产生IL-13，而CD4+T细胞产生的IL-13几乎可以忽略不计（图5）。
在小鼠建立AAD后，使用抗IL-13单抗来中和IL-13（图6a）。与同型对照相比，抗IL-13单抗在VEH和DEX组均消除AHR（图6B），此外，IL-13的中和作用显著抑制了上述两组患者的BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的浸润。在VEH组和DEX组中，杯状细胞增生，黏液分泌过多，抗IL-13单抗治疗显著降低了嗜酸性粒细胞数量增加，肺组织炎症评分升高（图6c）。抗IL-13单抗治疗可显著降低了肺的病理改变水平（图6D）。总的来说，这些数据表明IL-13在诱导脂多糖调节的类固醇耐药AHR和气道炎症中至关重要，并且在脂多糖诱导的哮喘加重过程中，该细胞因子主要由CD8+T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞产生。
研究人员通过IPA对嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞在典型通路和上游调控因子两个方面进行基因富集分析，激活z值最高的典型通路基因子集主要与“EIF2 Signaling”有关，其次是“Oxidative Phosphorylation”和“Signaling by Rho Family GTPase”。而且，“stress-related response”、 “generation of reactive oxygen species”“ cell motility”这三个参与调节细胞功能和类固醇抗性的通路同时都出现在这三个细胞簇中（图7A）。
根据上游调控因子分析预测，许多上游调控因子的激活增强，包括STK11、NFE2L2、Hbb-b1、IFNγ、CD38和IL-5的激活增强。 除了位于CD8+记忆T细胞中的TLR4，ILC2中的TLR3/IL-1β，以及嗜碱性粒细胞中的IL-4/Myc，大多数上游调节因子的激活都是对类固醇有耐药性。MyD88、TLR3、TLR4、EGR1、Retnlb和NF-κB只在嗜碱性粒细胞簇中被激活。
同样，EGFR和CHUK只在ILC2中被激活，TCF3，TCF4和SMAD3在CD8+记忆T细胞中被激活。地塞米松治疗促进了CD8+记忆T细胞中STAT1/BCR/PPARGC1A的激活、ILC2中IKBKG/MKNK1PITX2/CD28和嗜碱性粒细胞中TICAM1/IFNAR的激活（图7B）。这些上游调控因子的转录本在这三个SAL、VEH和DEX组的细胞簇中显著上调（图7C）。
研究结论
本研究通过小鼠肺免疫细胞的单细胞转录分析，为理解炎症基因在单个细胞水平上的共享和不同的表达模式提供了一个框架。它揭示了对疾病进展至关重要的多细胞信号通路和评估在疾病过程中出现的不同细胞群的重要性提供了一种细胞资源，由CD8+记忆T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞产生的IL-13是驱动哮喘加重发病机制的关键细胞因子。这些信息可以作为开发细胞靶向疗法来治疗和预防哮喘恶化的基准。
参考文献Wang
L, Netto KG, Zhou L, et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals
the immune landscape of lung in steroid-resistant asthma exacerbation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021; 118(2): e2005590118.
王贝 | 文案
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