文献分享 | 用于SARS-CoV-2 和其他呼吸道感染病原检测的高通量多重检测方法

述评
围绕病原微生物相关的原理、机制,以及各类检测和分析技术及其应用的推进,相关进展日新月异。为帮助大家及时了解最新进展,301感染论坛特开辟文献分享版块,定期分享最新文献的阅读体会。       

本期,为大家分享一篇高通量检测呼吸道病毒的文献。之所以选择该文献作为本版块的首期,是因为该研究针对目前最受关注的SARS-CoV-2,通过组合不同检测方法,尽管并未在检测技术层面有所突破,却采用了及其巧妙的检测策略,并实现了对多种病原的高通量多重检测。给我们突出的启示是:在充分了解和掌握相关检测技术的基本原理的前提下,应用巧妙的策略组合,能够发挥相关技术的巨大效能。好比采用NGS技术的宏基因组和全基因组分析,也是采用相同的检测技术和不同的分析策略,以实现不同分析目标的逻辑。难点不在技术原理本身,而在于我们如何充分理解相关的思路、逻辑、技术路线、应用路径,并在此基础上建立和发展更多、更高效的检测方法和分析策略。

摘要

为应对新冠肺炎大规模流行,我们需要一种高通量、低成本、高效益的检测方法来监控病毒传播。SARSeq,一种应用RNA测序同时对上万份漱口液标本进行SARS-CoV-2 和其他呼吸道病毒检测的试验方法,它结合多重 RT-PCR 反应和新一代测序技术,使用二维、双标签策略实现标本的准确识别和高通量检测,灵敏度和稳定性与定量 RT-PCR方法相当,并可拓展应用于同时检测甲型/乙型流感病毒及人鼻病毒等其他病原体。

前言

保持社交距离和采取封锁措施可有效遏制新冠疫情,但会对经济社会发展产生负面影响。因此需要对密切接触者和无症状个体进行病毒分子检测和监测,识别感染人群并提供所需的信息,保证措施的精准实施。病毒检测方法主要有两种:抗原检测和核酸检测。抗原检测灵敏度低、方法开发耗时;RT-qPCR方法灵敏度高,但检测通量受成本和设备限制。一种具有高通量和低成本高效益的检测方案是RT-PCR和测序技术的结合,目前已开发了一些检测方法,但在灵敏度、特异性、通量、成本效益等其中一个或多个方面存在问题。本研究中,开发了名为SARSeq的高通量检测方法,可以同时对数万份标本进行SARS-CoV-2 和其他呼吸道病毒的检测,TAT约为 1 天。整体流程如下图:

方法和结果

样本处理方法的评估:收集一个SARS-CoV-2阴性病例和两个阳性病例的漱口液样本,分别应用95℃热灭活、蛋白酶K、TCEP / EDTA溶液或QuickExtract溶液处理标本,通过对病毒特异性扩增子(N基因)进行RT-qPCR 来评估 RNA 提取效果和RNA稳定性,结果表明所有方法都能生成稳定的 RNA,并且与纯化后的 RNA具有相似的灵敏度,说明SARS-CoV-2 核酸检测不需要经过RNA纯化过程,从而更加便于实现高通量检测。

标本标签添加时机的评估:标本识别标签可以在逆转录过程或PCR过程中通过扩增子的引物进行添加。但是研究中发现在逆转录过程中添加标本标签会因为反应期间温度较低而产生大部分非特异性 PCR产物。因此确定应用两步反应,首先使用随机六聚体加上两个基因特异性12聚体进行逆转录反应,其中基因特异性 12聚体可提高对 SARS-CoV-2 的敏感性;然后在PCR反应期间添加标本标签。

不同阳性标本中病毒载量存在差异的处理:不同SARS-CoV-2阳性标本的RT-qPCR检测结果可能存在多达25个Ct 值的差异,转化为病毒滴度即225  = 3.35×107 倍的差异。如果病毒滴度低的标本可以被可靠地鉴定为阳性,例如病毒测序扩增子序列数>100,则病毒滴度高的标本将需要3.3×109序列数,这是不可取的。因此,本研究对每个样品进行了45个循环的PCR反应,使扩增子数量达到饱和。在不同初始病毒滴度的情况下,每个标本生成了相似数量的扩增子,从而能够汇集许多样本以供NGS分析。

优化病毒RNA特异性引物和内部质控引物:由于18S扩增子不跨越内含子,无法区分呼吸道样本中丰富的基因组 DNA模板。因此设计了一个额外的内部 RNA 对照(逆转录质控RTC),其引物结合位点与18S核糖体扩增子相同但中间有一个不相关的序列,来评估逆转录过程。此外,还可以根据核糖体扩增子和 RTC序列数之间的比率评估标本质量:在漱口液标本质量良好的情况下,核糖体扩增子和 RTC序列数的比率较高且 RTC检测率较低。该策略还监测样品是否含有RT和/或PCR抑制剂。

二维冗余双标签策略:使用冗余双标签策略保证标本识别的特异性,两个标签通过正向和反向引物引入,对每个样本在扩增子的两端用不同的标签进行冗余编码,从而去除不正确的标签组合。这种方法需要每个样本有两个标签,在使用单个 PCR 时(一维)不能很好地扩展。因此引入了二维标签策略,通过两个PCR 步骤实现:在使用双标签策略执行第一次 PCR 后,将一个板内的所有样品汇集到第二个板的同一个孔中,然后使用双标签策略再次执行第二次PCR。这种二维冗余双标签策略允许在两个维度之间进行组合,从而进行乘法缩放,同时保持标本识别的准确性。流程见下图:

第一次 PCR(第一维)的扩增子特异性引物3′ 端包括样品特异性标签和 i5/i7序列作为第二次 PCR的引物结合位点。将一个板的所有样品汇集到新的 96 孔板的一个位置,在第二次PCR中添加板特异性标签(第二维),并采取了三项措施以确保在两轮PCR反应中标本识别的准确性:

1)引入具有与N1和N3引物结合位点相同的RNA 模板,以在PCR1反应中消耗PCR1引物。

2)用 DNA 核酸外切酶处理 PCR1产物,酶解所有单链 DNA,从而降解所有剩余的引物,尤其是      SARS-CoV-2 阴性孔的引物。

3)将 PCR2 的循环数保持在最低限度,以避免在 PCR期间发生扩增子重组。

通过使用 PCR添加两组冗余标签,以及生物信息学仅允许这四个标签的合法组合,为 SARS-CoV-2 扩增子提供可扩展且稳定的标签。一轮便能够对 96 孔标签(第一维)和 384 孔板标签(第二维)进行编码意味着这可用于同时检测36,864 个标本。

 SARSeq的特异性和敏感性:首先通过将病毒模板稀释到每个反应1、3或10个拷贝来评估SARSeq的敏感性,每个稀释度检测24次重复。使用水稀释时1拷贝分子的检测效率为30-40%,使用QuickExtract稀释可以将该效率提高到70%,检测限至少比 SARS-CoV-2 大流行缓解策略所需的敏感度高100倍。收集健康参与者的漱口液标本,所有漱口液标本之前都通过qPCR检测呈阴性,将合成的SARS-CoV-2 RNA 和阳性患者样本(Ct=30)的稀释液添加到几个标记位置,除阳性漱口液标本10-5稀释度未检出外,所有具有 N1 和 N3 扩增子的阳性样品均可检出,表明具有非常高的灵敏度。

通过添加合成的 SARS-CoV-2 RNA 或阳性患者标本的稀释液生成4952个阴性样本和728个阳性样本,检测到两个意外的 N1阳性样本和五个意外的 N3阳性样本,估计方法的假阳性率为 0.04-0.1%。

SARSeq可在一次反应中检测多种呼吸道病毒:通过优化甲型流感病毒、乙型流感病毒和鼻病毒的引物,以与SARS-CoV-2 特异性的SARSeq方法结合。多病毒实验没有产生任何假阴性结果,也没有看到任何假阳性结果。


讨论

SARSeq可以并行分析多达 36,000 个样本,在扩增子水平和标本识别水平上显示出高特异性;SARSeq分析的每个样本的成本较低(在内部测试中约为 2欧元);除 NGS 外,SARSeq 完全依赖大多数分子生物学实验室中目前拥有的可用设备。

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