抗体偶联药物（ADC）将细胞毒性药物的效力与单克隆抗体(mAb)的高抗原特异性结合，其中DAR（抗体药物偶联比）是ADC药物的一个重要质量参数，影响药物安全性和有效性。疏水相互作用色谱(HIC)、反相高效色谱（RPLC）、高分辨质谱（HRMS）已被证明是测定ADC药物DAR值的有效方法，然而这些方法均有一定的局限性。随着多维LC/MS方法的发展，2D-LC和4D-LC/MS已被用于表征ADC药物，与传统的离线方法相比，可显著缩短检测时间。
来自瑞士日内瓦大学的Alexandre团队在Analytical Chemistry发表了题为“Streamlined Characterization of an Antibody−drug Conjugate by Two-Dimensional and Four-Dimensional Liquid Chromatography/Mass Spectrometry”的研究长文。【文献原文PDF获取，请在微信公众号对话框回复关键词：抗体药物表征】
作者首次开发了利用多维LC/MS（2D或者4D）快速表征ADC药物大小变异体的方法。传统SEC方法需要在流动相中添加15%以上的有机相来降低ADC药物的疏水性，然而高浓度有机溶剂可能引起蛋白质构象的变化或非共价聚集体的变性。作者利用新型UHP-SEC色谱柱（超高效体积排阻色谱法），流动相仅需添加5%异丙醇，主峰和二聚体之间的分离度可达2.7。在2D-LC(SEC-HIC)方法中，作者比较了单体、二聚体、多聚体的平均DAR值，测定的单体平均DAR值为3.5−3.6，与HIC法测定的DAR值一致，然而由于二聚体和多聚体具有更高的异质性，在HIC图谱不能得到二聚体和多聚体DAR值。相比于2D-LC方法，4D- LC/MS (SEC-还原-胰蛋白酶消化- RPHPLC)方法可同时测定单体、二聚体及多聚体的DAR值，该方法先通过一维UHP-SEC分离ADC药物，然后经过在线还原和消化，进而利用反相色谱测定DAR值，同时可以得到氧化和脱酰胺等翻译后修饰的信息。
总体而言，与标准的离线分析方法相比，多维LC/MS提供了一种简化的、在线的和自动化的ADC表征方法，整个数据采集流程在一天内完成，而传统的离线方法需要多天。并且该方法还为在一个实验中同时测定ADC药物DAR值和PTM奠定基础。另外，本研究还有一些独特见解，揭示了ADC高偶联药物以及较高比例的PTM修饰可能与聚集体形成的潜在区域有关，这可能对药物早期开发阶段候选抗体的设计提供理论依据。
结果分析（概要）
一、UHP-SEC分析非变性条件下的ADC
新型UHP-SEC色谱柱已经被证明可以显著减少蛋白质和固定相之间的非特异性相互作用，从而可以降低流动相有机溶剂的比例。研究人员发现，在添加5%异丙醇条件下，主峰和标准品二聚体之间的分离度达2.7，图1显示了在不同的应力条件下的SEC图谱，与对照相比，在氧化和光照条件下，二聚体比例显著增加，在酸性和加热条件下，多聚体的比例显著增加。
图1：ADC药物在不同应力条件下的的SEC图谱。对照品(蓝色)和应力样品(热应力为棕色，光应力为紫色，碱性应力为绿色，酸性应力为黄色，氧化应力为黑色)。
二、非变性条件下ADC大小变异体的SEC-HIC方法的发展
为了测定ADC药物不同大小变异体在非变性条件下的平均DAR，研究人员提出了一种SEC-HIC方法。图2显示了不同应力条件下，单体、二聚体、多聚体在SEC- HIC条件下的图谱。其中，单体的平均DAR(图2II,a)在3.3到3.6之间，这与标准HIC方法测定DAR值的结果相一致。二聚体峰尖(图2II,b)比DAR4物种的保留时间更靠后(图2II,a)，这表明相对于单体而言，二聚体的平均疏水性增强，多聚体(尤其是紫色和绿色的曲线)的疏水性增强表现得更为明显，表明存在更高DAR的物种。由于二聚体和多聚体的异质性，不能根据HIC图谱直接得到平均DAR值。因此需要一种互补的方法来测定多聚体的平均DAR。
图2：SEC- HIC二维液相的示意图，首先通过SEC实现ADC药物分馏，然后通过HIC测定DAR值。(I, a – c) 对照品SEC峰图(蓝色)、光照压力条件下SEC峰图（紫色），碱性pH条件下SEC峰图（绿色）和酸性pH条件下SEC峰图(橙色)。(II, a -c) SEC中心馏分的HIC色谱图。
三、4D-LC/MS（SEC-还原-胰蛋白酶消化- RPHPLC）分析ADC大小变异体的方法研究
为了进一步研究ADC聚合物，研究人员提出了4D-LC/MS方法。图3显示了不同应力条件下，单体、二聚体、多聚体在4D-LC/MS条件下的图谱。通过4D-LC/MS方法测定对照品和应力样品中二聚体的平均DAR为3.7 ~ 5.2，多聚体的平均DAR为4.8 ~ 5.7。分析发现，与单体相比，二聚体和多聚体的低偶联HC(未偶联HC和HC + 1drug)的量逐渐减少，而高偶联HC (HC + 2drug和HC + 3drug)的量则逐渐增加，高DAR样品(从DAR 4到DAR 8)更容易产生聚集，尤其是含有高偶联HC (HC + 2drug和HC + 3drug)的药物。同时4D-LC/MS方法可以测定ADC药物PTM，研究人员通过在线肽图分析确定两个主要的蛋氨酸氧化位点（M1和M3），结果显示在光照和氧化条件下蛋氨酸氧化比例均大于50%，在光照和氧化条件下，相比于单体，多聚体M3位点氧化比例高10%，这表明聚集体或参与聚集体形成的抗体区域的稳定性降低。
图3.自动化4D-LC工作流示意图，通过SEC (1D)进行ADC大小变异体的分离，然后通过RPHPLC进行柱上还原(2D)，在流动模式下的胰蛋白酶消化(3D)，以及通过RPHPLC进行肽图分析(4D)，4D反相色谱柱流出的溶液进入MS分析。(I, a, b) ADC样品的正常条件下SEC峰图(蓝色)、加热条件下SEC峰图（棕色）、光照压力条件下SEC峰图（紫色）、碱性pH条件下SEC峰图（绿色）、酸性pH条件下SEC峰图(橙色)和氧化条件下SEC峰图（黑色）；(II, a−c)SEC主峰组分通过RPHPLC（2D）在线还原并过滤；(III, a-c) SEC主峰组分通过RPHPLC（4D）在线还原及酶解。
百蓁生物应用2D-LC/MS方法提供简化、在线、自动化的ADC药物及多抗药物的表征分析服务，助力抗体药物研发，2022年4月22日，百蓁生物总部Bioinformatics Solutions Inc.公司的应用部门经理Kyle Hoffman博士介绍通过质谱方法如何进行抗体偶联药物（Antibody-drug Conjugate，ADC）表征的研究。
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