北京大学第一医院杨莉课题组和北京大学生物医学前沿创新中心白凡课题组合作进行相关研究，研究成果于今年2月发表在Advanced Science 杂志，该研究应用单细胞转录组测序技术深度解析了急性肾损伤中外周血、肾脏，以及脾脏单核巨噬细胞动态变化图谱，揭示急性肾损伤急性期始动和放大炎症损伤的巨噬细胞新亚群，应用小分子药物靶向该亚群有效降低急性肾损伤小鼠死亡率、减轻肾损伤程度以及远期肾脏纤维化。
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单细胞RNA测序确定一个独特的炎症巨噬细胞亚群可作为减轻急性肾损伤的药物靶点
Single Cell RNA Sequencing Identifies a Unique Inflammatory Macrophage Subset as a Druggable Target for Alleviating Acute Kidney Injury
【发表杂志】Advanced Science（IF：16.806）；
【发表时间】2022年2月；
【应用技术】10x Genomics单细胞转录组测序；
研究背景
急性肾损伤（Acute Kidney Injury，AKI）是临床常见的急危重症，住院患者中发生率约为10%，病死率约为25%，迄今为止尚无有效的治疗药物，医疗消耗巨大。目前已知，巨噬细胞在急性肾损伤的疾病进展过程中发挥重要作用，然而，由于巨噬细胞在损伤的器官组织局部呈现复杂的功能和表型异质性，因此发现急性肾损伤中导致组织炎性损伤的关键巨噬细胞亚型是实现精准靶向治疗的前提。
主要结果
1. IRI-AKI小鼠模型的单核巨噬细胞亚群图谱绘制
为全面了解AKI急性损伤期单核巨噬细胞（MPCs）的潜在来源及动态特征，研究者用单侧肾脏缺血再灌注的急性肾损伤小鼠模型，取NC和单侧缺血再灌注（uIRI）后第1天(D1)、第3天(D3)后的肾脏、血液和脾脏样本进行消化。经流式分选后，将各时间点的肾脏样本中Cd11b+细胞和F4/80+细胞的1:1混合，血液样品本的Cd11b+细胞和Ly6c+细胞的1:1混合，脾脏样本中的Cd11b+细胞，进行10X Genomics进行单细胞转录组测序（图1A），最终共获得80829个单细胞。根据MPC特异性基因表达分析，得到28884个MPCs，通过无监督聚类进一步分为32个亚群（图1B）。此外，还发现AKI急性损伤期肾脏组织中的巨噬细胞，74.69%来源于外周血单核巨噬细胞（图1C）。
2. KRMs和单核细巨噬细胞在IRI-AKI急性期起互补作用
通过分析观察到的细胞数与预期细胞数的比值(Ro/e)，发现各MPC亚群表现出不同的组织偏好（图1A）。聚类分析显示，稳态中出现的4个主要MPC亚群，在IRI后仍在肾脏中(图2B)，且4个亚群高表达肾脏巨噬细胞（KRM）的标记基因，由此推断这4个亚群为肾脏固有巨噬细胞。在损伤后D1，肾脏出现新的细胞亚群，且它们在血液和脾脏样本的UMAP图上定位在相同的位置(图2B)，说明这些亚群为单核细胞来源的浸润巨噬细胞（IMs）。并根据单核细胞maker基因Ly6c2 表达的高低将亚群分为Ly6chiIMs，Ly6cintIMs和Ly6clowIMs。
GO分析显示，KRM在损伤后的功能主要集中在抗原呈递，修复系统及其他免疫细胞的激活（图2H）。Ly6clowIM在维持内皮细胞的稳定，调节血管生成和离子的运输中发挥了更多的作用（图2H）。Ly6chiIMs在凋亡细胞清除、急性炎症反应和促炎能力方面法发挥作用，但在维持体内稳态方面的作用不明显。综上，KRMs和IMs在IRI-AKI急性期起互补作用，Ly6chiIMs可能是促进肾脏炎症的主要因素。
3.AKI急性期单核巨噬细胞的功能分析
差异表达分析发现，在损伤后D1, 与外周血Ly6chi单核细胞相比, 肾脏Ly6chiIMs中与促进单核细胞向巨噬细胞分化相关的基因高表达，此外，趋化因子及受体，炎症调节等基因的表达也相对提高（图3A）。
RNA velocity伪时间分析显示，浸润到肾脏后，Ly6chiIMs的四个亚群有向Arg1hiC5发展的趋势。为了进一步描述分化过程，研究者对Ly6chiIMs到Arg1hiC5发育轨迹上进行差异表达基因(DEGs)，并定义了三个基因表达模块，显示了从炎症信号特征到促修复表型的基因表达程序（图3D,3E）。
通过RNA velocity伪时间分析，还发现KRM-c4与Arg1hiC5之间存在相互转化。在损伤后D1, KRM-C4部分转化为Arg1hiC5（图3F），而在D3，则检测到从Arg1hiC5向KRM-C4的发展趋势(图3G)。与D1相比，Arg1hiC5在D3开始表达KRM标记基因(图3H)。免疫组化证实，肾损伤后存在Arg1hi巨噬细胞(图3I)。
4. S100a9hiLy6chi巨噬细胞最早响应肾损伤信号
RNA velocity伪时间分析显示，S100a9hiLy6chi巨噬细胞是血源性单核细胞胞轨迹的起点(图4A)。并通过流式细胞（图4B和4C），免疫荧光（图4D和4F），趋化因子芯片（图4E），单细胞测序（图4G）等技术，证实S100a9hiLy6chi为最早响应KRMs和TECs释放的肾损伤信号的血源性巨噬细胞。
5. AKI急性期S100a9hiLy6chi巨噬细胞是促炎反应的关键效应因子和放大因子
较其他Ly6chiIM亚型，S100a9hiLy6chi IMs中炎症相关基因表达水平最高(图5A)，炎症能力以及趋化因子和趋化因子受体的生产能力最高(图5B)， 炎症相关通路被富集（图5C）。此外，S100a9hiLy6chiIMs与其他Ly6chiIM亚群以及KRMs的相互作用最强(图5D)。以上数据说明S100a9hiLy6chiIMs可能是IRI肾脏促炎反应的关键效应因子和放大因子。
PPI分析发现，S100a8/a9 受体Tlr4和下游NF-KB信号通路明显富集(图5E)。S100a8/a9受体基因Tlr4在KRM-C3、C4和Ly6chiIMs中均有表达，炎症通路组分在KRMs和Ly6chiIMs中也均有表达(图5F)。配体-受体分析显示，S100a9hiLy6chi IMs的S100a8/a9配体(C6)与KRMs或Ly6chiIMs上的受体Tlr4的相互作用最强(图5G)。通过免疫荧光染色发现Tlr4在S100a8/a9+细胞中高表达(图5H)，而S100a8或S100a9在肾脏中的表达与肾小管病理损伤评分的程度和肾脏中Cd11b+ MPCs的浸润数量相关(图5I)。综上，S100a9hiLy6chi IMs可能通过S100a8/a9-Tlr4-NFKB通路，促进和放大炎性反应，从而恶化肾小管病理损伤。
研究者进一步在人类AKI肾活检组织中发现S100A8/A9阳性巨噬细胞的浸润并与肾组织损伤程度、肾小管细胞凋亡、以及肾功能损伤程度相关(图6B,C)。S100A8/A9阳性巨噬细胞显著浸润肾小管壁、并进入肾小管腔(图6 d-f)，提示其具有侵袭性，在人类AKI中亦发挥炎性损伤作用。
6. 在IRI小鼠模型中，靶向抑制S100a8/a9可保护肾脏免受损伤
在uIRI-AKI小鼠模型中，对特异性S100a9抑制剂TAS和PAQ处理后的样本进行检测。流式细胞分析发现，药物处理后显肾脏中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著降低，免疫染色显示S100a8和S100a9明显减少。表达分析结果显示，Tlr4和p-Nfkb的蛋白水平明显降低。促炎细胞因子、趋化因子和趋化因子受体被显著抑制，而修复性巨噬细胞表型的标志性基因得以维持或增强。此外，TAS或PAQ给药后肾小管细胞坏死和凋亡程度较低，肾小管细胞中修复性生长因子表达增加，肾纤维化程度显著降低。
为了进一步证实抗S100a8/a9治疗对IRI-AKI的保护作用，在小鼠模型上进行了bIRI。结果显示，TAS或PAQ治疗能够降低bIRI-AKI小鼠的7天死亡率，血清肌酐水平显著降低。与对照组相比，经TAS或PAQ处理的bIRI-AKI小鼠肾小管坏死和凋亡减轻，巨噬细胞和中性粒细胞浸润减少。
研究结论
本研究中，绘制了急性损伤期肾脏单核巨噬细胞亚群图谱并进行细胞溯源和功能分析，发现在AKI急性损伤期肾脏组织中的巨噬细胞除4群固有巨噬细胞（KRM）外，74.69%来源于外周血单核巨噬细胞。单细胞转录组测序发现了S100a9hiLy6chi IMs亚群，此类巨噬细胞是最早响应肾损伤信号的白细胞类型，在接收到损伤肾脏释放的IL-6，Cxcl1等分子信号作用和招募下，快速从骨髓释放入血并迁移至损伤肾脏，通过S100a8/a9-Tlr4-Nfκb等信号通路促进AKI后局部炎症反应的放大。应用特异性S100a8/a9抑制剂小分子药物可以有效降低AKI小鼠死亡率，保护肾功能，减轻肾脏炎症反应以及远期纤维化。
参考文献
Yao W, Chen Y, Li Z, et al. Single Cell RNA Sequencing Identifies a Unique Inflammatory Macrophage Subset as a Druggable Target for Alleviating Acute Kidney Injury [published online ahead of print, 2022 Feb 3]. Adv Sci. 2022; e2103675.
王盼飞 | 文案
————关于百奥益康————
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