2021年10月18号，来自黑龙江八一农垦大学寄生虫课题组王春仁团队在Front Cell Infect Microbiol杂志上在线发表了题为“Identification of Myoferlin, a Potential Serodiagnostic Antigen of Clonorchiasis, Immunoproteomic Analysis of Sera From Different Infection Periods and Excretory-Secretory Products of Clonorchis sinensis”的研究论文。华支睾吸虫病是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）引起的一种重要的食源性疾病。该研究采用液相色谱串联质谱法 （LC-MS/MS）进行了免疫共沉淀（Co-IP）分析（青莲百奥提供技术支持），以探究C. sinensis的排泄分泌产物（ESP）作为病原体在宿主-寄生虫相互作用中发挥的重要作用。
华支睾吸虫是一种重要的食源性病原体。它主要影响哺乳动物，如狗、猫和人类，其典型的临床症状包括黄疸、胆管炎和胆道梗阻。华支睾吸虫病还与肝纤维化、其他人类肝胆疾病和胆管癌（CCA）密切相关。因此，在该研究中，分别在感染后7天、14天、35天和77天收集感染华支睾吸虫的兔血清和华支睾吸虫成虫，并进行免疫共沉淀（Co-IP）实验同时结合液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对免疫复合物进行评估和表征。该研究的目的是确定ESP中敏感性和特异性的抗原靶点，并为华支睾吸虫病提供更多潜在的诊断靶点。
实验结果
C. Sinensis ESP蛋白检测
C. sinensis成虫的ESP中大部分蛋白的分子量为10~170ku，共检测到334个蛋白，其中有注释信息的蛋白为254个。
不同感染时期与兔血清互作的C. sinensis ESP蛋白检测
使用免疫蛋白质组学方法来鉴定C. sinensis分泌的蛋白质，特别是使用感染血清拉下来可能参与宿主-寄生虫相互作用的C. sinensis ESP。Co-IP结果显示，第7、14、35 和77天血清中的抗体可以识别并拉下来自C. sinensis ESP 的特定蛋白，并且大多数蛋白的分子量范围为15至170 ku。LC-MS/MS结果显示，5种蛋白只能在早期（7天）检测到，这可能解释了它们在宿主中诱导了早期反应，并且发现3种蛋白在四个时期都特异性的表达，包括动力蛋白轻链1（dynein light chain-1）、动力蛋白轻链2（dynein light chain-2）和myoferlin蛋白，这三种蛋白参与机体运动和能量代谢，在不同阶段均表现出高表达，从而为C. sinensis提供能量。
互作蛋白的KEGG信号通路分析
挑选了在C. sinensis中检测到，但在F. livera和S. japonicum中未检测到的27种参与宿主-寄生虫相互作用的蛋白。KEGG分析显示，这些蛋白主要参与氧化磷酸化、膜转运、信号转导和代谢等途径。并且每个感染时期的蛋白丰度不同，cystoskeleton、氧化磷酸化和mRNA surveillance pathway相关蛋白在感染早期（7天）高表达，可能参与早期免疫逃避。在寄生虫感染中期（14天），膜运输相关蛋白明显增加，可能在为寄生虫提供能量方面发挥重要作用。NOD-like受体信号通路、谷胱甘肽代谢和溶酶体相关蛋白在感染晚期（35天和77天）高表达；C. sinensis分泌的溶酶体可以有效灭活宿主释放的蛋白质以保护自身。
重组蛋白的基因克隆及抗原性分析
为了获得更好的表达，根据生物信息学提供的抗原表位，将myoferlin蛋白截断为两部分（Myof1和Myof2）。利用特异性寡核苷酸引物扩增Myof1和Myof2（1500bp和810bp）基因，并将其克隆到大肠杆菌pET32a表达载体中。克隆的Myof1和Myof2在大肠杆菌BL21细胞中成功表达。对重组蛋白进行SDS-PAGE分析，分子量约为60ku（Myof1）和31ku（Myof2）。该蛋白在C. sinensis感染兔的血清可进行不同水平的检测，而在S. japonica和F. hepatica感染兔的血清中未检测出，说明myoferlin蛋白可能是检测华支睾吸虫病的潜在抗原。
小结
华支睾吸虫病是一种食源性吸虫病，在中国、韩国和越南等地区备受关注。流行病学和实验研究报道，华支睾吸虫感染可诱发胆管上皮增生、胆管纤维化、胆管囊变，也可能促进胆管癌的发生。C. sinensis不断地从排泄口向外界释放ESP（蛋白质、碳水化合物和脂质等复杂混合物），暴露于ESP的细胞会产生多种病理生理反应，包括增殖、凋亡、氧化还原稳态破坏和炎症等。因此，鉴定ESP中蛋白组成对于我们了解寄生虫诱导的发病机制至关重要。结果表明，该研究使用的免疫蛋白质组学方法可能对华支睾吸虫病的血清抗原诊断具有重要作用。此外，myoferlin蛋白可能作为华支睾吸虫病免疫学诊断的潜在biomarker。
华支睾吸虫不同感染时期的血清和排泄-分泌产物的免疫蛋白质组学分析
期刊名称：Front Cell Infect Microbiol
影响因子：4.123
样本选择：
感染华支睾吸虫后7天、14天、35天和77天的兔血清和对照兔血清样本；
F. livera和S. japonicum感染的阳性兔血清（用于对照的病原菌）；
从感染兔的胆管中分离华支睾吸虫成虫提取ESP蛋白。
技术策略：免疫蛋白质组学（CoIP-MS）
编辑：简爽
校稿：杨云飞
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