Ripa蛋白真的可靠吗?文献指出存在这些误解

Ripa裂解液用于从样品中提取总蛋白已有30多年的历史,但您是否考虑过它是否适合您的下游实验?例如,Ripa提到的蛋白质图谱是否完整?提取的蛋白质与其他方法有什么区别?使用时是否存在任何潜在问题?一句话:Ripa可靠吗?

我最近看到好几篇文章这么说。

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➤ 研究方法

  1. 分别使用 RIPA 和 2%SDS+超声提取未激活 T 淋巴细胞(Lanes 1 和 5)和激活的 T 淋巴细胞(Lanes 2-4 和 6-8)裂解细胞提取总蛋白

  2. WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 活性检测

➤ 主要发现

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中,但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。

划重点:细胞凋亡研究时要慎用RIPA

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➤ 研究方法

  1. 培养的结肠癌细胞分别使用 RIPA 和 NP-40 提取

  2. 用特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀

  3. 使用同样量 pp60-src 沉淀蛋白进行激酶检测

➤ 主要发现

  1. 使用 RIPA 提取蛋白,激酶活性比 NP-40 提取高了七倍

  2. RIPA buffer 人工增加激酶活性

划重点:激酶活性检测时要慎用RIPA

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➤ 研究方法

  1. 研究使用化学诱导和无诱导的人细胞系,总蛋白分别使用 RIPA 和柱式法蛋白提取

  2. 蛋白通过 SDS-PAGE 分离,进行 WB 检测磷酸化蛋白的对比

  3. NT=细胞没有通过化学处理激活(基线水平),T=细胞通过化学激活处理。化学激活后,磷酸化蛋白(p)预期应比基线水平(NT)增加,非磷酸化蛋白(np)减少。

➤ 主要发现

  1. 通过 actin 条带强度可以证明蛋白样品是等量上样

  2. STAT3 在两种提取方法中显示了同样的趋势

  3. P56 在两种提取方法中却显示明显的不同

  4. 离心管柱法提取蛋白获得了预期的结果,但是 RIPA 获得了完全相反的结果

Mukhopadhyay, C. et al. (2016). PNAS. 5: 8228-8237.

➤ 研究方法

  1. 野生型和突变型乳腺上皮细胞通过 RIPA 裂解液裂解,通过离心获取 RIPA 可溶性和不可溶性组份

  2. RIPA 不可溶性组份用 SDS-PAGE 样品缓冲液溶解,使用多种抗体进行验证

➤ 主要发现

  1. RIPA 不可溶性组份中有明显的蛋白丢失情况

  2. 野生型和突变型样品均有丢失蛋白,包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白(pY-416c-Src)

划重点:在某些蛋白质磷酸化研究中慎用RIPA

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Lamber CM Ngoka (2008). Proteome Science. 6:1 (1).

➤ 研究方法

  1. 使用 RIPA buffer 提取乳腺癌组织中总蛋白

  2. RIPA 方法提取丢弃的不可溶性组份通过尿素裂解液再次提取蛋白

  3. 通过质谱分析两部分蛋白质图谱

➤ 主要发现

  1. RIPA buffer 提取后不可溶性组份中含有很多种蛋白

  2. 几乎所有的细胞外基质蛋白都存在于不溶性组分中

    不溶性组分中蛋白质的分子量平均高出 60%

    RIPA 在 4 种乳腺癌样品提取中都产生了明显的蛋白丢失,主要是高分子量蛋白

    划重点:细胞外基质研究时慎用RIPA

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BioTechniques 61:327 (December 2016)

➤ 研究方法

  1. 小鼠组织样品分别使用离心管柱法和 RIPA buffer 提取总蛋白

  2. RIPA 提取后不可溶组份进一步使用离心管柱法进行提取

  3. 提取后的蛋白通过 SDS-PAGE 分离,考染进行对比

➤ 主要发现

  1. RIPA 不可溶组份仍可以提取出蛋白,分子量从小于 20KD 到大于 120KD 范围,证明 RIPA 提蛋白有丢失

  2. 最明显的区域是低分子量蛋白

  3. 蛋白丢失是具有选择性,且不成比例的

  4. 不同的样品间蛋白丢失的图谱是不同的

划重点:定量,定性蛋白研究慎用RIPA

What?看完一脸懵 X 吗?用了这么久的 RIPA 居然有这么多慎用,这也太不靠谱了,那该怎么办?

如果正在做以上实验研究遇到问题,那么务必要使用不同提取蛋白的方法来验证结果!有没有一种方法能够解决 RIPA 蛋白提取中的问题呢?

美国 Invent 公司带来的离心管柱技术,是蛋白提取的新方法,只需加入裂解液,过柱离心,不产生不可溶组份,1 分钟轻松解决蛋白丢失问题。

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