这次的文章选自《分子细胞》杂志的“一种由假定的lncRNA HOXB-AS3编码的肽抑制结肠癌生长”一文。
高转移癌细胞和原发癌中hoxb-as3 lncrna水平降低。通过RNA测序研究RNA表达差异。癌细胞中lncrna hoxb-as3水平低于正常细胞。然而，hoxb-as3的功能尚不清楚。作者进一步证实，与亲代细胞系相比，高转移性结肠癌（SW620和htc-116high）、乳腺癌（mda-mb-231high）、鼻咽癌（S18）和卵巢癌（sk-ov-3high和ovcar-3high）的癌细胞亚群中hoxb-as3 RNA水平降低（图S1A和S1b）。接下来，作者研究了六对匹配的新鲜冷冻原发性结直肠癌组织及其相应的非肿瘤性（NT）结肠组织中hoxb-as3 RNA的水平。与相应NT组织中的hoxb-as3 RNA水平相比，这些原发性结直肠癌组织中的hoxb-as3 RNA水平也下调（图1a）。
Lncrna hoxb-as3编码一个小肽hoxb-as3，最初被注释为人类Lncrna基因（nr_0332010.2）。然而，核糖体分析显示hoxb-as3 RNA与核糖体结合，表明hoxb-as3可能编码蛋白质或小肽。作者进一步在包括人类在内的灵长类动物中发现了一个短的159 NT小ORF，它可能编码一个高度保守的53 AA肽（图1b），但在任何其他物种中都没有发现编码hoxb-as3肽和人类159 NT ORF序列的同源核苷酸序列（数据未显示）。序列比较未发现与任何其他蛋白质和经典结构域/基序的同源性，这增加了lncrna hoxb-as3编码未知小肽的可能性。为了研究hoxb-as3 ORF的起始密码子是否活跃，通过将gfpmut ORF（起始密码子atggtg突变为attgtt）融合到ORF的C端和全长hoxb-as3转录本中的5’utr ORF中生成了一系列结构（图1c）。在转染hoxb-as3 ORF gfpmut和5’utr-ofr-gfpmut的细胞中观察到hoxb-as3-gfp融合蛋白的大量表达（图1D）。然而，hoxb-as3-gfp融合蛋白的表达消除了hoxb-as3 ORF起始密码子从ATG到att（5’utr-orfmut-gfpmut）的突变（图1D）。使用抗GFP抗体的Western blot分析进一步证实hoxb-as3-GFP融合蛋白在hoxb-as3 orf gfpmut-和5’utr-orf-gfpmut转染细胞中显示预测的相对分子量，而在hoxb-as3 5’utr-orfmut-gfpmut转染细胞中显示预测的相对分子量（图1E）。GFP标记物的大小大于hoxb-as3小肽的大小。在许多研究中，GFP标记的蛋白质改变了蛋白质的特定表型。因此，这里产生了一系列结构，其中flag标签（六个氨基酸）与全长hoxb-as3转录本中的ORF或5’utr-ORF的C端融合（图1g）。在hoxb-as3 ORF flag-和5’utr-ofr-flag转染细胞中观察到hoxb-as3-flag融合蛋白的大量表达（图1h-i）。然而，hoxb-as3-ORF起始密码子从ATG突变为att（5’utr-ofrmut flag），消除了hoxb-as3-flag融合蛋白的表达（图1h-i）。这些结果与使用hoxb-as3-gfp融合蛋白发现的结果相似。因此，在随后的实验中使用了flag-tag融合结构。为了检测细胞中hoxb-as3 ORF编码的肽，作者制备了抗hoxb-as3肽的抗体。使用抗Hoxb-as3抗体在Hoxb-as3 ORF flag-和5’utr-ofr-flag转染细胞中检测到Hoxb-as3-flag融合蛋白，但Hoxb-as3 ORF起始密码子突变（5’utr-ofrmut flag）取消了对Hoxb-as3-flag融合蛋白的检测（图1i-j）。在hoxb-as3-gfp融合蛋白中观察到类似的结果（图1e-f）。总之，这些数据表明hoxb-as3融合蛋白在细胞中表达。
图1
HOXB-AS3肽是天然，内源性产生的
为了检测HOXB-AS3 ORF编码的细胞中天然产生的内源性肽，使用抗HOXB-AS3抗体检测了细胞HOXB-AS3肽。验证了HOXB-AS3肽在CRC SW620和SW480细胞中的存在（图2 A），并且证实了HOXB-AS3肽是结肠，乳腺癌，卵巢和鼻咽癌细胞中天然，内源性产生的（图2 B），表明HOXB-AS3肽在各种组织中广泛表达。为了排除内源性产生的HOXB-AS3肽不是由其他更长的蛋白质加工而成，可使用抗HOXB-AS3的翻译阻断反义寡核苷酸来阻断HOXB-AS3肽的翻译。如图2C所示，抗HOXB-AS3翻译阻断反义寡核苷酸完全阻断了HOXB-AS3肽的表达。
图2
HOXB-AS3肽水平低表明CRC患者的预后不良
为了检查HOXB-AS3肽在CRC癌变中的作用，分析了六对匹配的新鲜原发CRC组织和相应的NT组织以及具有不同转移水平的癌细胞亚系中HOXB-AS3肽的水平。与它们的亲代细胞系相比，HOXB-AS3肽水平在高度转移的结肠，乳腺，鼻咽和卵巢癌细胞亚系中也被下调（图3B）。与相应的NT组织相比，初级CRC组织中的HOXB-AS3肽水平与HOXB-AS3 RNA水平相似（图3D）。
此外，使用IHC对90对匹配的CRC和相应的NT组织样品进行了广泛的组织微阵列分析（图3 E）。与NT组织相比，CRC组织中检测到的HOXB-AS3肽水平降低（图3F）。HOXB-AS3肽水平降低与CRC的更高级临床分期呈正相关（p = 0.037）。Kaplan-Meier生存分析表明，与HOXB-AS3表达水平较高的患者相比，HOXB-AS3肽水平较低的患者患CRC相关死亡的风险增加（图3 G-H；p＜0.0001） 。患有HOXB-AS3的CRC患者的平均总生存时间低为46.0个月，而HOXB-AS3高的CRC患者为75.0个月。因此，降低的HOXB-AS3肽水平与CRC患者的不良预后相关。
HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3 lncRNA抑制CRC的生长
为了研究HOXB-AS3肽和lncRNA对癌症进展的影响，将全部包含Flag标签的HOXB-AS3 ORF，5’UTR-ORF和5’UTR-ORFmut构建体转染到低HOXB的CRC细胞中-AS3表达式。均表达HOXB-AS3肽的HOXB-AS3 ORF和5’UTR-ORF构建体均抑制癌细胞集落的形成，生长，迁移和侵袭（图3A-C）。相反，5’UTR-ORFmut包含突变的HOXB-AS3起始密码子，因此不编码HOXB-AS3肽，不会改变CRC细胞的生长，集落形成，迁移或侵袭（图3 A-C ）。
更重要的是，如图3 D所示，由HOXB-AS3 ORF和5’UTR-ORF稳定转染的细胞组成的CRC异种移植的体内生长明显受到损害。然而，HOXB-AS3 5’UTR-ORFmut的异位稳定表达并未显着改变CRC异种移植肿瘤的生长。此外，尾静脉注射荧光素标记的HOXB-AS3 ORF或5 UTR-ORF稳定表达的HTC-116细胞后，小鼠肺中出现了较小的转移性结节，但在HOXB-AS3 5 UTR-ORFmut稳定表达的HTC-116细胞中则没有(图3E)。通过组织学分析进一步证实了肺转移性结节（图3F）。这些数据提供了直接的证据，表明HOXB-AS3基因的肽产物而不是其lncRNA在体外抑制癌细胞的生长，菌落形成，迁移和侵袭以及体内的肿瘤发生。总体而言，这些数据表明HOXB-AS3编码了一种小肽，起着抑癌作用。
图3
HOXB-AS3肽与hnRNP A1蛋白相互作用
HOXB-AS3肽是未表征的小肽，与其他蛋白质缺乏同源性。为了进一步研究HOXB-AS3肽在癌症进展中的作用机制，鉴定了与HOXB-AS3肽相互作用的蛋白质（图4 A）。
为了表征这些HOXB-AS3相互作用蛋白的功能作用，使用生物信息学对它们的生物学过程和蛋白-蛋白相互作用网络进行了分析。蛋白质-蛋白质相互作用测定与基因本体论（GO）注释测定结合显示，与HOXB-AS3肽相互作用的大多数蛋白质都参与RNA剪接（图4 B），这表明HOXB-AS3肽可能会调节细胞RNA剪接。
作者进一步证实了在存在或不存在RNase A处理的情况下HOXB-AS3与hnRNP A1之间的相互作用（图4 C-D），表明HOXB-AS3与hnRNP A1的相互作用与RNA无关。
HnRNP A1由两个RNA识别基序（RRM1和RRM2），一个与RNA结合的RGG框（RGG）和一个核靶向序列（M9）组成。为了研究哪些域与HOXB-AS3肽相互作用，作者生成了带有C端HA标签的hnRNP A1截短的构建体，并在HOK293T细胞中与HOXB-AS3-Flag共表达（图4 E）。只有含有RGG框结构域的构建体，而不包含hnRNP A1的其他区域，才能保留与HOXB-AS3肽相互作用的能力，这表明hnRNP A1的RGG框对于HOXB-AS3结合是必不可少的（图4 F-G） 。 作者发现HOXB-AS3肽结合了宽型的hnRNP A1，但未结合hnRNP A1 AGG突变体（图4H-J），表明RGG基序中精氨酸残基的突变破坏了hnRNP A1与HOXB-AS3的相互作用。肽和RGG基序中的精氨酸残基对于HOXB-AS3结合至关重要。
图4
本文涉及技术： 流式细胞术
本文涉及技术： 多重免疫组化
本文涉及技术： 单/多因子检测