随着人口老龄化的加剧，骨质疏松性骨折的发病率也随之增加。老年患者的骨折愈合过程缓慢，恢复时间长，易发生骨折延迟愈合，这不仅会导致患者长期卧床，还会增加死亡风险和医疗成本。目前的治疗方法可以降低骨折风险，但不能加速骨折愈合。为了找到有效的治疗策略，需要深入了解愈合过程背后的机制。
感觉神经纤维传递痛觉信号，在骨折后尤为明显。大量研究表明，CGRP+（降钙素基因相关肽）感觉神经在器官形成和组织再生过程中发挥着重要的作用。此外，最新研究表明，CGRP+感觉神经中的TrkA（原肌球蛋白受体激酶A）信号传导对骨折修复至关重要。神经生长因子通过激活TrkA信号通路启动骨折修复。然而，CGRP+感觉神经中的TrkA信号是否也会影响骨质疏松性骨折的骨折修复，目前仍不确定。
近日，上海交通大学医学院附属同仁医院的研究团队深入探索了骨质疏松性骨折发生时阻碍骨重建的病理机制。他们发现，病理性破骨细胞（Cx3cr1+iOC）的增加抑制了CGRP+TrkA+感觉神经信号传导，在很大程度上导致愈伤组织重建的延迟。这项研究成果发表在《Cell Death & Differentiation》杂志上，加深了我们对骨折延迟愈合的病理机制的了解。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员通过双侧卵巢切除构建了骨质疏松症小鼠模型。他们采用Micro-CT分析来评估愈伤组织的形成、骨体积分数（BV/TV）以及骨小梁的数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th），并通过H&E染色和SO-FG染色来观察愈伤组织的形成和矿化。为证实Cx3cr1+iOC和Sema3A在愈伤组织重建中的作用，他们采用赛业生物提供的Cx3cr1-Cre、DTRflox/flox和Sema3Aflox/flox小鼠构建了条件性基因敲除小鼠；此外，还委托赛业生物构建了Sema3A的干扰shRNA来沉默Cx3cr1+iOC中的Sema3A的表达。
技术路线
01
构建骨质疏松症小鼠模型并诱导骨折，探索愈伤组织重建与Cx3cr1+iOC之间的关联
02
构建条件性敲除Cx3cr1+iOC的小鼠模型，验证Cx3cr1+iOC在愈伤组织重建中的作用
03
深入探究Cx3cr1+iOC通过CGRP+TrkA+信号通路影响愈伤组织重建的机制
04
通过临床样本确认Cx3cr1+iOC与CGRP+TrkA+信号传导之间的关联
研究结果
1
Cx3cr1+iOC的上调与骨小梁形成的减少相关
考虑到骨质疏松性骨折经常发生在绝经后妇女身上，研究人员对10周大的WT小鼠进行了双侧卵巢切除（OVX）手术，并在术后8周诱导股骨骨折。为了探索骨质疏松症对骨折愈合的影响，他们在骨折后的不同时间点对OVX组和对照组小鼠开展了Micro-CT分析。结果显示，OVX组的愈伤组织形成和重建明显少于对照组。在骨折后两周和四周，OVX组小鼠的骨体积分数（BV/TV）与对照组相比大幅下降，骨小梁的数量和厚度也降低。
骨折愈合通常包括三个阶段：炎症阶段、愈伤组织形成和愈伤组织重建。愈伤组织重建作为最后的修复阶段，对骨骼恢复正常功能很重要。破骨细胞在此过程中发挥关键的调节作用。它通过“吞噬吸收”机制参与骨骼重建，将愈伤组织转化为骨小梁结构。最近的研究发现，当骨质疏松症发生时，炎症性破骨细胞（iOC）高水平表达趋化因子Cx3cr1。
染色结果显示，对照组小鼠骨折部位在愈合过程的早期形成了软骨愈伤组织，这种组织随后成功矿化并重建成骨小梁。相比之下，OVX组小鼠的早期愈伤组织形成受到抑制，导致后期骨小梁矿化延迟。双重免疫荧光染色显示，WT小鼠的愈伤组织内主要为Trap+阳性细胞（TRAP是破骨细胞功能的标志物），而OVX小鼠的Cx3cr1+Trap+细胞数量显著增加。因此，在骨质疏松性骨折修复中，愈伤组织重建和骨小梁形成的抑制与Cx3cr1+iOC的上调有关。
为了验证Cx3cr1+iOC在愈伤组织重建中的作用，研究人员建立了一种条件性敲除Cx3cr1+iOC的小鼠模型（图1），其中Cx3cr1-Cre和DTRflox/flox小鼠由赛业生物提供。与WT OVX小鼠相比，Cx3cr1+iOC缺陷型OVX小鼠的愈伤组织重建和骨小梁形成明显增强，愈伤组织的骨体积分数也增加了28.6%。同时，这种缺陷型小鼠的骨愈伤组织中的骨钙素（OCN）表达水平升高，骨钙素在愈伤组织的矿化过程中起重要作用。因此，条件性敲除Cx3cr1+iOC可能会抵消骨愈伤组织重建受损的趋势。
2
Cx3cr1+iOC抑制CGRP+TrkA+感觉神经信号传导
基于上述结果，研究人员假设，Cx3cr1+iOC的增加可能会抑制愈伤组织内的神经信号传递。为了验证这一假设，他们重点观察了骨愈伤组织重建过程中的感觉神经信号传导。与WT OVX小鼠相比，Cx3cr1+iOC缺陷型OVX小鼠愈伤组织中的CGRP蛋白水平高77倍。令人惊讶的是，这种缺陷型小鼠的TrkA蛋白水平比WT OVX小鼠高出近124倍。这些结果表明，骨折部位CGRP+TrkA+信号传导的减少与愈伤组织的重建受损有关，而Cx3cr1+iOC的条件性敲除会增强感觉神经的CGRP+TrkA+信号传导。
接下来，研究人员进一步分析了Cx3cr1+iOC如何通过CGRP+TrkA+信号通路影响愈伤组织的重建。考虑到骨骼中广泛表达的信号素（Sema）会抑制轴突生长，他们评估了愈伤组织中的信号素表达，发现Cx3cr1+iOC分泌的Sema3A显著增加。利用Sema3A shRNA（由赛业生物提供）来沉默Cx3cr1+iOC中的Sema3A后，他们发现TUBB3蛋白表达明显增加，表明轴突再生增加。此外，Sema3A的沉默导致背根神经节细胞中的CGRP及TrkA磷酸化大幅增加。后续的分析显示，Cx3cr1+iOC分泌的Sema3A通过GSK3β–Akt通路抑制CGRP+TrkA+感觉神经信号传导。
为了进一步证实Sema3A的作用，研究人员对小鼠Cx3cr1+iOC中的Sema3A进行靶向敲除（其中Sema3Aflox/flox小鼠由赛业生物提供）。染色结果显示，Sema3A缺陷型OVX小鼠中的愈伤组织矿化和骨小梁形成均显著增强。此外，与对照组相比，缺陷型小鼠愈伤组织中CGRP蛋白的表达水平增加了108倍，TrkA蛋白的表达量也提高了90倍。这些结果表明，特异性敲除Cx3cr1+iOC中的Sema3A可逆转骨质疏松性骨折中CGRP+TrkA+信号传导的缺失。
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Sema3A抑制剂TCS1105可逆转骨折延迟愈合
之后，研究人员分析了Sema3A是否可作为骨质疏松性骨折的治疗靶点（图2）。TCS1105是一种Sema3A抑制剂，可阻止Sema3A诱导的感觉神经元轴突生长缺陷。他们发现，TCS1105治疗可促进OVX小鼠的骨愈伤组织形成和矿化。与对照组相比，TCS1105治疗组小鼠的骨体积分数大幅增加，骨小梁数量也显著增加（图2）。同时，TCS1105治疗组的新骨形成也明显增加，CGRP和OCN的表达量显著提高。因此，他们认为，以Sema3A为靶点是治疗骨质疏松性骨折的一种大有前景的策略。
4
Cx3cr1+iOC增加与CGRP+TrkA+信号传导减弱相关
最后，研究人员使用接受髋关节置换手术的88岁女性的股骨颈标本，并以55岁男性患者的股骨颈标本作为对照，评估了骨质疏松性骨折中的Cx3cr1+iOC和CGRP+TrkA+信号传导。他们发现，88岁女性患者的骨小梁数量明显少于男性患者，表明骨质疏松症更为严重。更重要的是，女性软骨下骨中的Cx3cr1+iOC明显增加。与对照组相比，骨质疏松性骨折中Cx3cr1和Sema3A的共定位程度明显更高，且CGRP、TrkA和TUBB3蛋白的表达水平明显降低。这些结果表明，在骨质疏松性骨折中，Cx3cr1+iOC的Sema3A表达升高与CGRP+TrkA+信号传导减弱之间存在密切关联。
研究结论
总的来说，研究人员发现，在骨质疏松性骨折的愈伤组织重建过程中，CGRP+TrkA+感觉神经信号传导的缺失与病理性破骨细胞（Cx3cr1+iOC）的增加有关。随后，通过特异性删除Cx3cr1+iOC以及Cx3cr1+iOC分泌的Sema3A，他们观察到愈伤组织中CGRP+TrkA+信号传导增强，且愈伤组织重建加速。通过临床样本，他们也证实了Cx3cr1+iOC与CGRP+TrkA+信号传导之间的调控关系（图3）。这些结果有望协助人们开发出策略来治疗骨折延迟愈合。
参考文献：
[1]Shu, Y., Tan, Z., Pan, Z. et al. Inhibition of inflammatory osteoclasts accelerates callus remodeling in osteoporotic fractures by enhancing CGRP+TrkA+ signaling. Cell Death Differ (2024). https://doi.org/10.1038/s41418-024-01368-5