肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤，也是2020年癌症死亡的第三大原因。肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的一种类型，占所有肝癌病例的80%至90%。尽管HCC的治疗方案比以往更加多样化，患者预后也有所改善，但早期转移和频繁复发导致晚期HCC患者的五年生存率较低。因此，迫切需要研究HCC的潜在分子机制并确定新的治疗靶点。
三基序蛋白8（TRIM8）是一种E3连接酶，通过介导K63连接或K48连接的多泛素化参与底物稳定性和功能的调节。之前的研究发现TRIM8在多种肿瘤类型中发挥双重作用（致癌或抑癌），但它在HCC中的作用和潜在机制还不清楚。
上海长征医院消化内科谢渭芬教授领导的研究团队近日发现，TRIM8通过介导肝细胞核因子1α（HNF1α）泛素化并促进其蛋白降解，在HCC进展过程中发挥了致癌作用。研究表明，以TRIM8-HNF1α为靶点也许是一种很有前景的HCC治疗策略。这项研究成果于6月15日发表在《Cell Death & Disease》杂志上。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员使用了人类HCC细胞系（包括Huh7、Hep3B和HepG2等）进行体外分析，并使用了雄性BALB/c裸鼠进行体内分析。他们采用慢病毒载体来实现TRIM8的过表达，并使用siRNA来降低TRIM8的表达。此外，研究人员还构建了TRIM8敲除的HepG2细胞系（由赛业生物提供），他们发现TRIM8基因的敲除显著抑制了HepG2细胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和质谱分析等，研究人员确认了TRIM8与HNF1α之间的相互作用及具体机制。
技术路线
01
通过分析TCGA数据发现TRIM8表达与HCC患者结局的临床相关性，并确定TRIM8对HCC恶性特征的影响
02
通过Co-IP和MS等分析发现TRIM8与HNF1α相互作用，并与HCC进展相关
03
通过CHX和Mg132处理发现TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径介导了HNF1α的降解
04
体外和体内分析表明HNF1α-K197R突变体可消除TRIM8的致癌作用
研究结果
1
TRIM8的上调与HCC患者预后较差相关
研究人员首先搜索了癌症基因组图谱（TCGA）数据集，以了解HCC组织中的TRIM8转录本水平。他们发现，与正常肝组织相比，TRIM8在HCC组织中的表达明显上调（图1）。他们还发现，TRIM8水平越高，HCC患者的无病生存期（DFS）和无复发生存期（RFS）越短。与癌旁组织相比，HCC组织中TRIM8 mRNA水平升高，蛋白表达水平也明显上调（图1）。这些数据表明，TRIM8可作为HCC的候选诊断标志物，其表达与HCC患者的结局存在临床相关性。
为了确定TRIM8对人类HCC细胞系恶性特征的影响，研究人员利用慢病毒载体在MHCC-L细胞中增强了TRIM8的表达，并利用siRNA降低了Huh7细胞中TRIM8的表达。他们发现，过表达TRIM8能显著促进HCC细胞在体外的增殖、集落形成、迁移和侵袭。相反，抑制它则会降低HCC细胞的恶性表型。他们还发现，TRIM8基因的敲除显著抑制了HepG2细胞的增殖和克隆形成（其中TRIM8-KO细胞由赛业生物构建）。因此，TRIM8在HCC中发挥了强大的致癌作用。
为了探索TRIM8发挥作用的潜在机制，他们利用TCGA数据库开展基因组富集分析。他们发现，DNA修复、DNA复制、G2/M检查点等多条癌症相关通路在TRIM8高表达的样本中上调。KEGG分析也显示，TRIM8相关基因参与了Wnt、Hippo和PPAR信号通路以及脂质和胆固醇代谢通路。此外，RNA测序还发现，HepG2细胞中的TRIM8基因敲除会抑制几条癌症相关通路，包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。
2
TRIM8与HNF1α相互作用
为了阐明TRIM8在HCC中的分子机制，研究人员开展免疫共沉淀（Co-IP）和质谱（MS）分析来寻找TRIM8的潜在底物。MS分析表明，肝细胞核因子1α（HNF1α）与TRIM8存在潜在的相互作用。HNF1α是一种重要的转录因子，主要在肝脏中表达，在肝细胞分化、代谢调控和肝功能维持中发挥作用。之前的研究发现，HNF1α的表达下降是HCC发生和发展的关键事件。
Co-IP实验证实了TRIM8与HNF1α的相互作用，邻位连接分析（PLA）进一步确定了TRIM8和HNF1α在Huh7细胞中的位置相邻（图2）。TCGA数据表明，TRIM8的表达与HNF1α靶基因的水平呈负相关。荧光素酶报告分析表明，TRIM8能显著抑制Huh7细胞中HNF1α的转录活性（图2）。通过IPA分析，他们还发现HNF1α过表达细胞和TRIM8敲除细胞中上调的DEG主要与细胞周期、检查点调控等通路有关，也参与了癌症和肝脏疾病的调节。这些结果表明，TRIM8与HNF1α相互作用，这种互作可能在HCC的发展过程中起了关键作用。
3
TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径促进HNF1α降解
通过TRIM8的过表达和敲降分析，研究人员发现TRIM8降低了HNF1α蛋白的表达。考虑到TRIM8是一种E3连接酶，他们认为TRIM8促进了HNF1α的降解。在使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理Huh7细胞时，TRIM8能显著缩短HNF1α的半衰期，而在过表达TRIM8后，HNF1α的降解速度明显加快。同时，在蛋白酶体抑制剂Mg132处理后，HNF1α蛋白的水平显著回升。他们还观察到，TRIM8促进了HNF1α的K48连接泛素化。由此可以看出，TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径介导了HNF1α的降解。
为了确定TRIM8介导的HNF1α泛素化位点，研究人员在Huh7细胞中过表达TRIM8，之后分离出泛素化蛋白。他们发现HNF1α的第197位赖氨酸残基被明显泛素化。在构建赖氨酸-精氨酸的突变体后，他们发现K197R突变延迟了环己酰亚胺处理后的HNF1α降解（图3）。进一步分析显示，K197R突变显著降低了HNF1α的泛素化，并抑制了TRIM8介导的HNF1α泛素化。这些数据表明，TRIM8在Lys197位点介导了HNF1α的泛素化。
4
阻断TIRM8介导的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用
最后，研究人员试图分析阻断TRIM8对HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他们用表达HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒载体感染过表达TRIM8的细胞，发现K197R突变体削弱了TRIM8对增殖、迁移和侵袭的促进作用。之后在裸鼠身上开展的体内分析表明，TRIM8的过表达促进了肿瘤的生长，而HNF1α-K197R逆转了TRIM8对小鼠肿瘤生长的促进作用。这些结果揭示了TRIM8通过介导HNF1α的降解在HCC中发挥致癌作用。
研究结论
总的来说，这项研究揭示了TRIM8通过对HNF1α的K48连接泛素化促进HCC恶性进展的新机制。它表明TRIM8-HNF1α轴既是预测HCC预后的潜在指标，也是有潜力的治疗靶点。研究人员认为，针对TRIM8介导HNF1α降解来设计方法，有望提高HCC患者的生存率。
参考文献：
[1]Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y