近年来，免疫检查点阻断疗法（ICB）在对抗癌症方面取得了很大进展。CTLA-4单抗是首个获批上市的免疫检查点抑制剂。作为一种抑制性检查点，CTLA-4在活化T细胞和肿瘤浸润调节性T（Treg）细胞上高表达。CTLA-4单抗不仅能够增强效应T细胞的功能，还能清除肿瘤内Treg细胞。然而，部分患者无法响应CTLA-4单抗治疗，而且治疗还会产生严重的免疫治疗相关不良反应。
肿瘤细胞为了维持生存会进行大量的有氧糖酵解，导致乳酸在肿瘤微环境中过度积累。目前已知Treg细胞利用乳酸来维持其免疫抑制功能。考虑到CTLA-4在Treg细胞中的重要性，乳酸是否调节Treg细胞中CTLA-4的表达，进而影响对CTLA-4阻断疗法的应答，这个问题值得深入探究。
近日，上海交通大学基础医学院邹强研究员领导的研究团队发现，乳酸通过RNA剪接机制促进肿瘤浸润Treg细胞中CTLA-4的表达，有助于提高CTLA-4阻断疗法的效果。这项研究成果发表在《Immunity》杂志上，确定了Treg细胞中乳酸与RNA剪接之间的机制关联，对自身免疫和抗肿瘤免疫具有治疗方面的意义。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员构建了多种条件性基因敲除小鼠模型（其中Slc16a1-floxed小鼠由赛业生物提供），以研究MCT1、USP39和CTLA-4蛋白的功能和关联。他们利用Treg细胞的单细胞转录组数据分析了乳酸摄取对转录程序的影响。在分析蛋白质相互作用时，他们采用了RNA免疫沉淀（RIP）以及CUT&RUN方法。在体外实验中，他们还从小鼠的脾脏和淋巴结中纯化出初始CD4+ T细胞，并诱导其分化为Treg细胞。
技术路线
01
敲除小鼠Treg细胞中的乳酸转运蛋白，以分析乳酸摄取对CTLA-4阻断疗法的影响
02
敲除小鼠Treg细胞和肿瘤浸润Treg细胞中的USP39，以分析USP39的功能作用
03
探索乳酸摄取对Treg细胞转录程序的影响，分析USP39缺失是否改变RNA剪接
04
确定乳酸影响RNA剪接和CTLA-4表达的分子机制
研究结果
1
Treg细胞摄取乳酸有助于提高CTLA-4阻断的效果
乳酸是由Treg细胞中的单羧酸转运蛋白1（MCT1）转运的。为了探讨Treg细胞对乳酸的利用是否会影响CTLA-4阻断疗法，研究人员将Slc16a1-floxed小鼠（由赛业生物提供，MCT1由Slc16a1基因编码）与Foxp3-Cre-YFP小鼠杂交，构建了条件性基因敲除小鼠（Slc16a1fl/flFoxp3-Cre），其Treg细胞中的Slc16a1被特异性敲除。
他们发现，CTLA-4抗体治疗能有效阻止瘤内Treg细胞的聚集，并激发强烈的抗肿瘤T细胞反应。不过，Slc16a1fl/flFoxp3-Cre荷瘤小鼠对CTLA-4抗体治疗未产生应答，它们在接受或未接受抗体治疗的情况下，肿瘤生长和抗肿瘤免疫并无明显差异，表明Treg细胞摄取乳酸有助于提高CTLA-4阻断的效果（图1）。
2
RNA剪接机制与肿瘤浸润Treg细胞特征有关
为了探索乳酸摄取对Treg细胞内在的转录程序有何影响，研究人员分析了结直肠癌中Treg细胞的单细胞转录组数据。他们发现，Treg细胞来源的RNA剪接过程与SLC16A1 mRNA的表达相关，且肿瘤浸润Treg细胞的RNA剪接相关通路特征打分高于外周Treg细胞。此外，SLC16A1的表达与泛素特异性蛋白酶39（USP39）的表达呈正相关，而USP39是RNA剪接机制的组分之一。这些结果表明，Treg细胞中的RNA剪接与肿瘤微环境中Treg细胞特征有关。
3
USP39通过CTLA-4维持Treg细胞的功能
接下来，研究人员构建了条件性基因敲除小鼠（Usp39fl/flFoxp3-Cre），其Treg细胞中的Usp39被特异性敲除。他们发现，这些小鼠出现致命的自身免疫表型，其严重程度与Foxp3缺陷型小鼠和CTLA-4缺陷型小鼠类似，表明Treg细胞介导的免疫抑制存在严重缺陷。此外，USP39缺陷型Treg细胞无法表达Treg细胞的特征基因，包括Foxp3、Ctla4、Pdcd1和Il10。这些结果表明，USP39缺失会破坏Treg细胞身份，导致致命的自身免疫。
他们之后特异性敲除了肿瘤浸润Treg细胞中的USP39，发现USP39的破坏明显抑制了肿瘤进展并提高了小鼠的存活率。在USP39缺陷型Foxp3+ Treg细胞中，CTLA-4的表达较低。他们还进一步敲除了小鼠Treg细胞中的CTLA-4和USP39，发现能够有效抑制肿瘤生长并促进抗肿瘤T细胞反应。不过在Ctla4fl/flFoxp3CreERT2荷瘤小鼠中，USP39缺失却不会改变肿瘤生长或抗肿瘤T细胞反应，表明USP39通过CTLA-4维持Treg细胞的免疫抑制功能。
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USP39促进Ctla4 RNA的高效剪接
那么，USP39缺失是否会改变Treg细胞的RNA剪接模式？转录组分析的结果表明，USP39缺失会导致1235个剪接事件发生改变，且USP39缺失导致50个和30个剪接位点的效率降低（图2），表明USP39对Treg细胞中的RNA剪接至关重要。USP39的缺失也导致Ctla4表达下降。RNA免疫沉淀分析表明，USP39与Ctla4 pre-mRNA结合（图2）。此外，USP39缺失会降低肿瘤浸润Treg细胞中Ctla4成熟mRNA与pre-mRNA的比例。这些数据表明，USP39是Ctla4 RNA高效剪接所必需的。
之后，研究人员利用体外系统探索了USP39对Treg细胞功能基因的RNA剪接有何作用。与对照相比，USP39缺失会降低Ctla4成熟mRNA与pre-mRNA的比例，但不会改变其他Treg细胞功能基因的RNA剪接效果，这表明USP39的缺失会选择性影响Treg细胞中Ctla4 RNA的剪接。雌性Usp39fl/flFoxp3-Cre/+小鼠的分析也证实了这一点，由于X染色体的随机失活，大约一半的Treg细胞缺乏USP39。这些结果表明，USP39介导的RNA剪接是Treg细胞中CTLA-4表达所必需的。
5
乳酸调节USP39介导的CTLA-4表达
最后，研究人员探究了Treg细胞中乳酸与USP39之间的潜在联系。他们在Usp39的启动子区域发现了Foxp3的结合位点。在乳酸处理后，Foxp3+ Treg细胞中USP39和CTLA-4表达水平增加，表明乳酸诱导Foxp3表达，然后促进Treg细胞中USP39依赖性的CTLA-4表达。在阻断乳酸摄取后，Usp39表达和Ctla4 RNA剪接效率降低，但USP39缺陷型Treg细胞中Ctla4 RNA剪接的效率没有改变。这些结果表明，在肿瘤浸润Treg细胞中，乳酸调节了USP39介导的CTLA-4表达。
研究结论
这项研究表明，乳酸通过调节RNA剪接来增加CTLA-4的表达并增强Treg细胞的免疫抑制功能，这有助于提高CTLA-4阻断疗法的效果。这些发现确定了一种环境机制，它能够维持Treg细胞内RNA剪接机制的活性，进而支持Treg细胞的功能状态和CTLA-4阻断的应答。研究还表明，抑制USP39可能会降低Treg细胞的抗肿瘤免疫屏障，对肿瘤治疗产生影响。
参考文献：
[1]Ding et al., Lactate modulates RNA splicing to promote CTLA-4 expression in tumor-infiltrating regulatory T cells, Immunity (2024), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019