标题：利用放射基因组分析解读具有微血管浸润的肝细胞癌的瘤内异质性
肝细胞癌(HCC)是一种具有双重血液供应特性的富含血管的肿瘤，极易发生微血管侵袭(MVI)。
有研究报道，HCC中MVI的发病率为30%-60%，其与临床分期和病理特征密切相关。MVI是导致HCC复发和转移的最重要病理机制。微血管的侵袭表明了肿瘤转移的趋势，微血管成为转移的第一站。
从细胞变化水平来看，MVI的发生与上皮-间充质转化(EMT)相关。在此过程中，肿瘤微环境(TME)重塑也可能在介导HCC侵袭中发挥重要作用。此外，大量证据表明，肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的相互作用有助于HCC的转移。然而，单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)可以帮助作者窥探MVI和HCC与TME的关系。
其次，不管是基于医生的经验还是相关研究都表明，肝细胞癌患者术前诊断MVI对制定治疗方案及争端都有重要的价值。许多研究主要集中在影像学特征和实验室检查上，以预测MVI，并显示出良好的预测效果。影像组学分析可以全面反映肿瘤的异质性。众所周知，基因组学是用来探索疾病背后生物学意义的重要法宝。因此，作者将放射组学和基因组学联合起来，具有非侵入性评估TME的潜力。然而关于放射组学特征与肝细胞癌TME关系的探索数据较少。
因此，该论文利用包括批量RNA测序(RNA-seq)和scRNA-seq在内的多维数据解剖了HCC和MVI的TME。此外，该论文还使用全外显子组测序(WES)和批量水平RNA-seq研究了肝内转移(IM)和HCC多中心发生(MO)的异质性。整合了影像组学数据，以说明影像组学特征与TME的生物学相关性。
思路亮点
1.该文章利用了多组学(基因组学和转录组学)及多类型数据(bluk RNA-seq和scRNA-seq)，对HCC和MVI的TME进行多维度及多方面的研究。
2.本文对单细胞数据的分析和免疫细胞的研究相对透彻，且文章思路联系紧密。
3.本文的可实现性较强。从数据的角度来讲，bulk RNA-seq数据和患者临床数据可从TCGA数据库里获取，TCGA患者的影像数据可在TCIA数据库中获得。scRNA-seq数据可在GEO数据库获取。
研究解读
△图1，研究设计的流程图
Step1，数据收集
该文章的数据包括来自复旦大学附属中山医院的肝细胞癌患者队列，包括56名HCC患者的RNA-seq数据、6名12例HCC结节患者有WES数据和6例scRNA-seq数据。放射组学有三个独立的数据集，包括复旦大学附属中山医院训练数据集(ZS队列，共150例患者)、南通大学附属医院外部数据集(NT队列，共88例患者)和复旦大学附属中山医院厦门分院校另一个外部数据集(ZSXM队列，共61例患者)。
Step2，成像分析和放射性组学特征提取
两名研究人员在互不干涉的条件下利用ITK-SNAP 软件进行手动肿瘤分割，并利用“PyRadiomics”R 软件包进行影像组学特征提取，影像特征包括动脉期、门静脉期和迟发期。其次，作者利用组内相关系数(ICC)评估感兴趣区域的一致性。最后，作者使用 z 评分方法对影像组学特征的值进行标准化。
Step3，预后影像组学模型和MVI预测影像组学模型的建立与验证
影像组学预后模型的构建，第一步利用单变量COX回归分析消除错误发现率(FDR)低于0.05的放射组学特征。第二步中，使用“glmnet”R包对初始步骤中选择的放射组学特征进行最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归，并设置“COX”作为算法。其次，根据其结果获得放射组学特征的系数，并计算每个患者的预后放射组学评分(Radscore)。为了确定将患者分为低风险组和高风险组的最佳临界值，作者利用了“survminer”R 包提供的基于最大对数秩检验的“surv_cutpoint”函数。其次，使用log-rank检验比较了总生存期（OS）的差异。最后，采用Kaplan-Meier分析评估生存率与预后Radscore的相关性。
MVI预测影像组学模型的构建，作者使用10次交叉验证LASSO 模型在训练队列中选择MVI相关的影像组学特征。然后，利用逻辑回归分析检验MVI预测模型的重要性。最后，作者利用ROC分析评估MVI预测Radscore 的预测价值。
Step4，scRNA-seq数据处理
肿瘤特异性APOE巨噬细胞与HCC的MVI相关
研究合并了所有样本的scRNA-seq数据。经过严格的质量控制，研究获得了55,525个单细胞的单细胞转录组，所有样本均与Harmony算法集成，以修正批量效应，进行了降维和无监督聚类分析。随后，这些细胞被分为九种主要细胞类型，包括巨噬细胞(CD163和CD68标记)、上皮细胞(EPCAM和CDH1标记)、CD8 T细胞(CD3D和CD8A识别)、CD4 T细胞(CD3D和CD4识别)、树突细胞 (ITGAX识别)、内皮细胞(PECAM1和vWF)，自然杀伤细胞(FGFBP2 和FCG3RA)、B/Plasma_B(CD19、JCHAIN 和 CD79A)和癌症相关成纤维细胞(ACTA2和COL1A2)(图2A)。每种细胞类型的浸润丰度在每位患者中是可变的，表明HCC进展的异质性(图2B)。例如，巨噬细胞在MVI HCC样本中的浸润率明显更高，而CD8 T细胞在MVI HCC样本中的浸润率更高。
作者推测巨噬细胞在HCC的MVI启动中发挥重要作用。因此，研究者专注于巨噬细胞，以评估浸润在两组MVI HCC组织中的不同亚群。巨噬细胞根据其独特的转录组特征被聚集成7个亚群(图2C)。注释的结果表明，APOE巨噬细胞在MVI HCC样品中显著富集(图2D)。GSVA显示，APOE巨噬细胞的脂质相关代谢、血管生成和上皮间充质转化水平升高(图2E)。通过计算M1/M2极化分数，作者发现 APOE 巨噬细胞偏向于M2极化(图2F)。生存分析表明，APOE巨噬细胞的更大浸润与MVI相关和更差的OS相关(图2G-H)。图2I热图显示每种巨噬细胞亚型中显着不同的转录因子基因。
△图2 MVI HCC和MVI+-HCC多细胞生态系统的scRNA-seq分析
T细胞在免疫微环境中起着不可或缺的作用。研究确定了6个主要组，包括3个CD8 T细胞簇和3个基于基因表达特征的CD4 T细胞簇。6种亚型分别为CD8_Naive T细胞、CD8_Effector T细胞、CD8_Exhausted T细胞、CD4_Treg、CD4_Memory T细胞和CD4_Effector T细胞(图3)。在MVI HCC样本中，CD8_Exhausted T细胞和CD4_Treg的浸润率高于MVI+++−肝细胞癌样本。此外，MVI HCC中浸润的CD8_Effector T细胞数量多于MVI+−肝细胞癌样本(图21A-D)。在 ZS 队列中观察到 APOE 巨噬细胞与 CD8_Effector T 细胞和 CD4_Treg 的高度相关性(图3E、F)。
为了确定APOE巨噬细胞的主要调节因子，SCENIC分析表明，肝白血病因子(HLF)是一种与肿瘤发生、免疫功能和代谢相关的转录因子，在APOE巨噬细胞中具有高度活性(图2I)。在队列中，HLF与GSVA计算的脂肪酸代谢和CD4_Treg浸润呈正相关(图3F)。
△图3，MVI+ HCC和MVI- HCC中T细胞的scRNAseq分析
APOE 巨噬细胞和 iCAFs 的相互作用可能有助于 HCC 的 MVI+
细胞通讯分析表明，这9种细胞类型之间的不同相互作用。巨噬细胞与CAFs之间的相互作用最为突出(图4A)。随后，作者破译了CAFs的亚簇，并根据特异性细胞标志物的表达确定了6个主要亚群：炎性CAFs(iCAFs)(以PDGFRA、IL-6、IL-11、CXCL1和CXCL2为标记)、基质CAFs(mCAFs)(以α-SMA和COL1A1为标记)、抗原呈递CAF(apCAFs)(以CD74和HLA-DRA为标记)、血管CAFs(vCAFs)(以MCAM、MYH1和MUSTN1)、CD36 CAF 和APOA2 CAF(图4B)。每个患者中CAFs亚簇的分布时，作者发现iCAFs在MVI HCC患者中富集(图4C)。高水平的iCAFs与较差的OS相关，表明iCAFs可能与HCC的进展有关(图4D)。为了研究APOE巨噬细胞和iCAFs是否具有互惠效应，作者利用ZS队列和TCGA队列观察到APOE巨噬细胞和iCAFs的高相关性(图4E-F)。与其他组相比，APOE巨噬细胞和iCAFs高的患者表现出最短的OS(图4G),这表明两种细胞类型的协同作用可以促进HCC的MVI。作者发现APOE巨噬细胞和iCAFs分别表现出SPP1和CD44的高表达。然后测定作者队列的HCC患者中SPP1和CD44的表达水平。结果表明，MVI HCC组SPP1和CD44的表达水平均较高(图4I-G)。
△图4，APOE巨噬细胞和iCAFs之间的相互作用网络
MVI HCC-和MVI HCC+之间的代谢异质性
代谢异常在肿瘤发生和转移中起主要作用。因此，作者比较了 MVI HCC和MVI之间的代谢途径活性利用GSVA的肝细胞癌。与氨基酸和碳水化合物途径相比，MVI阳性患者的脂质相关代谢途径显著富集(图5A)。为了研究哪种细胞类型在MVI的HCC代谢模式中占主导地位，作者使用ScMetabolism量化了九种细胞类型中包括脂质、碳水化合物和氨基酸在内的代谢途径的分数。作者发现巨噬细胞在患有 MVI 的 HCC 中具有更高的脂质相关代谢活性(图5B)。此外，在7个巨噬细胞亚群中，APOE巨噬细胞对脂质相关代谢的浸润显著更高(图5C)。作者还应用scFEA来计算不同巨噬细胞簇的代谢物丰度，结果表明脂肪酸和胆固醇在APOE巨噬细胞中明显富集(图5D)。上述结果表明，伴有MVI的HCC的特征是APOE巨噬细胞的脂质相关代谢异常增加。
Step4，影像组学评分与APOE巨噬细胞和iCAFs密切相关
作者探讨了影像组学特征是否可以预测HCC的MVI并具有预后价值。ZS 队列的 150 名患者、NT 队列的88名患者和ZSXM队列的 61 名患者参加了作者的研究。最终选择了六个放射组学特征来识别 MVI。识别 MVI 在训练队列、验证队列 A 和验证队列 B 中分别产生 0.857、0.684 和 0.780 的 AUC。基于16个预后影像组学特征构建风险预测模型。在训练队列、验证 A 队列和验证 B 队列中，高Radscore与HCC较差的OS显着相关。多因素Cox比例风险模型显示，高水平APOE巨噬细胞和高预后Radscore独立预测HCC患者OS较差。
此外，作者发现MVI预测Radscore也可以识别出APOE巨噬细胞和iCAFs的水平，疗效令人满意(AUC分别为0.872和0.639)(图6A-B)。高预后Radscore与高水平的iCAF和APOE巨噬细胞相关(图6C-D)。作者通过scRNA-seq数据比较了患者F(MVI阴性)和患者B(MVI阳性)的肿瘤微环境成分。患者 B 的 APOE 巨噬细胞和 iCAF 丰度高于患者 F(分别为 33.3% 和 19.5%、15.2% 和 9.4%)(图6E-F)。患者 B 的 MVI 预测 Radscore 和预后 Radscore 高于患者F。这些数据表明，影像组学可能是识别肿瘤微环境组成部分的一种有前途的方法。
△图6，影像组学评分与APOE巨噬细胞和iCAF相关
IM和MO之间的转录组谱和影像组学评分不同
由于IM是由MVI的进展引起的，作者收集了6名双焦点HCC患者的12个肿瘤样本和6个邻近的非肿瘤肝组织，以探索IM和MO之间的分子异质性。患者5和患者6存在MVI。为了区分IM和MO，作者进行了WES分析以检测突变率。作者发现IM由肝内转移发展而来，常见突变率高(患者5A：97.63%;患者5B：97.19%;患者6A：85.75%;患者 6B：85.59%)，而MO患者具有最小的共享突变(患者7A：9.26%;患者1B：8.53%;患者2 A：7.28%;患者2B：9.84%;患者3A：4.94%;患者3B：4.31%;患者4 A：9.18%;患者4B：8.92%)(图4B)。为了破译MO和IM的瘤内异质性，作者观察到与IM肿瘤相比，MO 肿瘤的基质评分水平通常较低，但免疫评分水平较高(图7C)。此外，与MO肿瘤相比，IM肿瘤表现出更高水平的APOE巨噬细胞和iCAFs(图7D)。由于术前难以实现IM和MO的鉴别诊断，因此放射组学可能是显示它们之间差异的有效工具。在作者的研究中，与MO相比，IM中预后Radscore高表达(图7E)。此外，对于MO肿瘤，与IM相比，每例患者的2个肿瘤具有更明显的分子和影像组学差异。患者1的两个HCC病灶的MRI也显示出明显的动脉增强模式，而患者5表现出相似的模式(图7F)。结果表明，IM比MO表现出更具侵袭性的肿瘤行为，并且预后Radscore具有无创地区分MO和IM的潜力。
△图7，IM和MO的转录组谱和影像组学评分不同
结论
作者的研究揭示了MVI阳性患者TME的变化，为新的辅助治疗提供了更详细的信息。可以特别注意减少MVI阳性患者的脂质代谢。此外，作者的研究将影像组学与TME相连接，从而实现对肿瘤微环境成分的无创评估，特别是在治疗过程中，可以优化患者的免疫治疗方案，降低MVI阳性患者的复发率。