胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤，对全球健康造成重大挑战。这种癌症的发病率逐年上升，但目前的治疗选择很有限。肿瘤微环境（TME）在胰腺癌的发生和发展中发挥重要作用，其特点是广泛纤维化，且存在癌症相关成纤维细胞（CAF）。CAF调节胰腺癌的发病过程，包括肿瘤生长、免疫逃逸和耐药性等。因此，靶向调节CAF是提高胰腺癌疗效的一种潜在策略。
细胞外囊泡（EV）经过改造，可将治疗剂（如遗传物质或药物）输送到目标位点，故引起了科学界的广泛兴趣。来源于骨髓间充质干细胞的细胞外囊泡（BMSC-EV）既具有EV的优势，又具有BMSC的相关特性，安全性高，在肿瘤发展过程中可被招募到TME并分化成CAF。因此，BMSC-EV是一种大有前景的胰腺癌治疗方法，有望破坏CAF和癌细胞之间的对话，逆转纤维化的TME，并改善治疗效果。
近日，南京医科大学第二附属医院张业伟教授领导的研究团队发现，工程化细胞外囊泡可以实现对CAF的靶向重编程，进而调控胰腺癌的肿瘤微环境。这项研究成果于2024年6月24日发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志（IF = 40.8）上，有望提高现有化疗方案的疗效，改善胰腺癌患者的预后。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员构建了以胰腺CAF为靶点的工程化细胞外囊泡（IEVs-PFD/138）。他们利用双荧光素酶报告实验和免疫共沉淀实验分析了miR-138-5p的作用机制。他们接着通过2D的细胞实验以及3D的多细胞肿瘤球状体实验和皮下异种移植模型，研究了IEVs-PFD/138对胰腺CAF靶向重编程的影响。最后，他们还利用C-NKG小鼠（由赛业生物提供，产品编号：C001316）构建了患者来源的异种移植（PDX）模型，并和胰腺癌原位小鼠模型研究了IEVs-PFD/138和吉西他滨的联合治疗效果。
技术路线
01
构建以胰腺CAF为靶点的工程化细胞外囊泡IEVs-PFD/138并表征其特征
02
确定miR-138-5p的目标基因，分析其在CAF中的作用机制
03
通过体外和体内分析研究IEVs-PFD/138对肿瘤生长和药物递送的影响
04
利用PDX模型和胰腺癌原位模型研究IEVs-PFD/138和吉西他滨的联合治疗效果
研究结果
1
IEVs-PFD/138的制备和表征
研究人员利用miRNA芯片比较了胰腺CAF和健康成纤维细胞（NF）之间的差异表达miRNA，发现miR-138-5p在两者之间差异较大。与NF相比，CAF中的miR-138-5p表达下调。在建立永生化的CAF细胞系后，他们发现miR-138-5p模拟物可降低CAF的增殖率和迁移率。由此可见，miR-138-5p可对CAF的表型进行重编程，且在胰腺CAF中的表达下调。
接下来，研究人员构建了以胰腺CAF为靶点的工程化细胞外囊泡。他们在来源于BMSC的EV中加入miR-138-5p模拟物和抗纤维化药物吡非尼酮（PFD），并用整合素α5靶向肽对其进行表面修饰，构建出IEVs-PFD/138（图1）。Western blot、透射电镜和纳米颗粒追踪分析证实了IEVs-PFD/138的各种特性。
之后他们检验了工程化IEVs的CAF靶向能力。与非靶向EVs相比，CAF对IEVs的吸收率更高。同样地，与IEVs-138共同孵育的CAF中的荧光信号高于与EVs-138共同孵育的CAF，证实整合素α5靶向肽提高了CAF靶向能力。在皮下纤维化胰腺癌模型中，IEVs的靶向能力高于未修饰的EVs。IEVs发出的荧光信号明显更高，表明IEVs到达胰腺癌部位的能力增强。
2
miR-138-5p在CAF中的功能机制
为了阐明miR-138-5p在CAF中的作用机制，研究人员在挖掘数据库后锁定了与CAF相关性最强的FERMT2。双荧光素酶报告实验的结果表明，miR-138-5p与FERMT2存在直接的相互作用。他们发现，FERMT2的表达与CAF的增殖和迁移呈正相关。在胰腺癌细胞群中，FERMT2表达量最高的是CAF，其次是癌细胞，表明该基因在肿瘤-基质相互作用和TME中发挥潜在作用。此外，FERMT2的病理评分与胰腺癌患者的临床分期呈正相关。
免疫共沉淀分析表明，FERMT2与TGFBR1发生相互作用。miR-138-5p直接抑制了FERMT2-TGFBR1复合物的形成，从而抑制了TGF-β信号通路的激活。此外，FERMT2还与胶原蛋白形成通路呈正相关，而PYCR1这种酶参与了脯氨酸代谢，调节胶原蛋白的沉积。分析发现miR-138-5p通过直接靶向FERMT2-PYCR1复合物，抑制了脯氨酸介导的胶原蛋白合成。
3
IEVs-PFD/138处理抑制了CAF的促肿瘤作用
体外分析表明，IEVs-PFD/138抑制了FERMT2-TGFBR1和FERMT2-PYCR1复合物的形成，并抑制了CAF中促炎因子和促肿瘤发生因子的产生。通过调节CAF中的脯氨酸代谢，IEVs-PFD/138还降低了细胞内的脯氨酸含量。此外，将EV处理后的CAF的条件培养基与胰腺癌细胞PANC-1共同培养后，研究人员发现IEVs-PFD/138能够高效抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭（图2）。
胰腺癌的TME中存在致密的细胞外基质，让抗癌疗法很难渗透。为了应对这一挑战，他们将PANC-1细胞与CAF共同培养，建立了富含基质的3D多细胞肿瘤球状体模型。在IEVs-PFD/138处理后，荧光探针渗透性增加，3D肿瘤球状体明显缩小，并在球状体周围观察到坏死细胞（图2）。这些结果表明，IEVs-PFD/138可通过抑制纤维化基质的形成和改善药物递送，增强小分子抗肿瘤药物在胰腺癌TME中的疗效。
为了研究IEVs-PFD/138在体内的治疗意义和机制，研究人员通过联合移植PANC-1细胞和CAF，建立了小鼠皮下胰腺癌模型，并在小鼠静脉中注射EVs，进行7个周期的治疗。结果表明，IEVs-PFD/138表现出明显的抗肿瘤效果，显著延长了裸鼠的存活时间。后续分析发现，IEVs-PFD/138处理能够抑制肿瘤细胞增殖和TGF-β信号通路，逆转CAF的激活，减少胶原蛋白的沉积，并且不会对重要器官产生毒性作用，表明这是一种很有前景的胰腺癌治疗策略。
4
IEVs-PFD/138和GEM在多个癌症模型中的联合治疗效果
之后，研究人员又利用C-NKG小鼠（由赛业生物提供）构建了患者来源异种移植（PDX）模型，并研究了IEVs-PFD/138和吉西他滨（GEM，一种化疗药物）的联合治疗效果（图3）。IEVs-PFD/138和GEM联合治疗组的肿瘤生长速度最慢，且肿瘤重量最轻。此外，IEVs-PFD/138能够有效减少肿瘤基质的生成，促进GEM向肿瘤细胞的递送，表明它有可能协同增强了GEM在PDX模型中的治疗效果。通过抑制TGF-β通路，IEVs-PFD/138还逆转了CAF的激活。另外，IEVs-PFD/138处理后，缺氧诱导因子HIF1A表达下调，而核苷转运蛋白ENT1表达增加，促进了细胞内GEM的积累，并改善了治疗反应（图3）。
研究人员最后还建立了胰腺癌原位小鼠模型，以便全面反映肿瘤生物学和治疗反应。他们在小鼠静脉中依次注射IEVs-PFD/138和GEM，进行7个周期的治疗。他们发现，GEM和IEVs-PFD/138的联合使用可显著抑制肿瘤生长。与对照组相比，联合治疗组的肿瘤体积最小，且小鼠均未发生腹膜转移。此外，IEVs-PFD/138促使CAF失活并抑制胶原蛋白分泌，降低了胶原蛋白含量。GEM能降低胰腺癌细胞的迁移能力，而IEVs-PFD/138的加入进一步增强了这种效果，与观察到的腹膜转移减少一致。
研究结论
这项研究展示了一种利用工程化EVs（IEVs-PFD/138）治疗胰腺癌的新方法。除了增强治疗药物的渗透性外，这种方法还直接抑制了CAF的肿瘤促进作用。IEVs-PFD/138与标准化疗药物GEM的联合治疗效果令人鼓舞，在小鼠模型中显示出抑制肿瘤生长和转移的协同效应。这种基于工程化EVs的策略为胰腺癌的治疗提供了新思路，有望改善胰腺癌患者的预后和生活质量。
参考文献：
[1]Zhou, P., Du, X., Jia, W. et al. Engineered extracellular vesicles for targeted reprogramming of cancer-associated fibroblasts to potentiate therapy of pancreatic cancer. Sig Transduct Target Ther 9, 151 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01872-7