急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）作为临床常见急腹症，病死率高达20-40%。近年来，随着饮食组成的改变，我国高甘油三酯血症性胰腺炎（Hypertriglyceridemic pancreatitis, HTGP）发病率呈逐年升高趋势，以“年轻化、重症化、易复发、并发症多”为主要临床特点，己超过酒精性胰腺炎成为AP的第二大类型，给临床救治工作带来极大困难。多项研究均已证实，HTGP伴有较高的病死率，易并发多脏器衰竭、感染性胰腺坏死等并发症，住院时间更长，再入院率更高。探究HTGP的发病机制将有利于延缓该病进展，以期为HTGP患者提供精准化、个体化的治疗策略。目前，有关HTGP发病机制研究多聚焦于脂质代谢、局部微循环、炎症反应及遗传性因素等方向。虽然相关研究逐年增加，但确切机制仍未完全阐明。
肠道菌群作为机体的重要组分，参与调控代谢产物合成、宿主防御及免疫调节等多种重要的生物学过程，对维持机体稳态与平衡有重要价值，有望成为胰腺疾病治疗的新靶点。然而，肠道菌群是否调节HTGP进展缺乏充足的实验证据，及其具体分子机制尚不清晰。
2023年10月4日，哈尔滨医科大学孙备团队在《Nature Communications》发表题为“Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis”的研究论文。该研究发现高甘油三酯血症性胰腺炎（HTGP）患者肠道单形拟杆菌（B.uniformis）丰度下调，导致其代谢产物牛磺酸迁移至胰腺内减少，进而激活中性粒细胞内NF-κB、IL-17信号通路及促进结肠IL-17释放加速胰腺中性粒细胞胞外捕获网形成（NETs），最终加剧HTGP胰腺损伤。本研究为肠道菌群恢复免疫动态平衡，缓解HTGP胰腺损伤提供有力证据。
研究材料
在这项研究中，研究人员使用了Gpihbp1敲除小鼠（由赛业生物提供，产品编号：S-KO-12718）构建了HTGP模型，以及使用了Pad4敲除小鼠（由赛业生物提供，产品编号：S-KO-03607）构建了NETs缺陷模型。
研究方法
采用了多种实验技术，包括各种组织学染色、WB、qPCR、转录组学测序（RNA-seq）、非靶向代谢组学、氨基酸靶向代谢组学、单细胞转录组测序、流式细胞术、免疫荧光、ELISA等。
技术路线
01
检测高甘油三酯血症性胰腺炎患者的肠道菌群变化情况
02
移植HTGP患者粪便显著加重疾病严重程度，并发现特异性菌群改变（Bacteroides uniformis）与HTGP进展密切相关
03
肠道菌群衍生的牛磺酸可迁移至胰腺直接抑制NF-κB、IL-17信号通路激活减少胰腺NETs形成
04
肠道菌群可抑制结肠Th17激活并减少IL-17通过“肠-胰轴”向胰腺释放，缓解胰腺NETs形成
研究结果
为研究HTGP患者特异性菌群差异，研究人员比较三组人群样本肠道菌群间的菌群丰度差异。相较于健康人群（HC）组，HTGP患者肠道菌群的α多样性显著降低（图1a），β多样性显示 HTGP、HTG及HC人群的肠道菌群组成与结构具有显著差异（图1b）。基于属、种水平分析，研究团队发现HTGP患者的肠球菌及大肠埃希菌等条件性致病菌丰度显著上调，而 Faecalibacterium prausnitzii，Faecalibacterium，Bacteroides uniformis 等有益菌丰度丰度显著下调（LDA>4, P上述结果揭示了肠道菌群标志物在HTGP诊治中的临床价值。
为明确是否肠道菌群变化直接导致HTGP进展，研究人员利用FMT构建菌群人源化小鼠模型，并对FMT后各组小鼠进行病理学相关检测。结果显示：相较于移植健康人群组，移植HTGP患者粪便（FMT-HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度、炎症指标（淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-1β）水平均显著升高（图2a-c）。16S检测发现FMT-HTGP组肠道菌群的α多样性显著降低（图2d），β多样性显示三组肠道菌群组成与结构具有显著差异（图2e）。基于种水平分析， Bacteroides uniformis同样在FMT-HTGP组中显著下调（P
为证明肠道菌群对HTGP胰腺组织免疫细胞的调控，流式细胞术发现FMT-HTGP组小鼠胰腺中性粒细胞的募集与活化显著增强，CD45+Ly6g+细胞比例升高（图3a）。进一步利用免疫组化比较胰腺组织中性粒细胞的表达与分布，结果提示：Ly6g在FMT-HTGP组中表达显著上调（图3b）。转录组测序显示差异mRNA表达数据进行功能预测分析，提示FMT-HTGP组胰腺中的白细胞活化、中性粒细胞浸润及中性粒细胞脱颗粒等功能富集显著上调（图3b, d）。单细胞数据经过t-SNE降维聚类、差异表达基因分析，研究人员通过细胞注释获得13类细胞（图3e），同样印证了中性粒细胞在FMT-HTGP组中占比明显升高（图3f）。Cxcl2、Il23a、Ccl6、Ccl21等介导中性粒细胞趋化的基因在FMT-HTGP组上调，并发现介导NETs形成的关键基因Padi4、Cd177、MPO等在FMT-HTGP组中同样显著上调（图3g）。GSEA分析提示，相较于FMT-HC组，FMT-HTGP组中性粒细胞的NETs通路富集评分及其激活的关键基因更高（图3h, i）。提取两组小鼠外周血中性粒细胞，细胞染色SYTOX观察NETs形成差异，显示FMT-HTGP组NETs形成明显增强（图3j），胰腺组织内同样证实FMT-HTGP中NETs激活明显增强（图3k-l）。
B.uniformis在HTGP患者和FMT-HTGP组明显降低（图4a-b）。为探究B.uniformis是否通过中性粒细胞发挥作用，研究者进行B.uniformis灌胃而后构建HTGP模型。结果发现：B.uniformis缓解HTGP胰腺损伤（图4c），减轻HTGP炎症反应。B.uniformis干预可缓解HTGP病程中胰腺中性粒细胞的过度募集及胰腺NETs形成（图4d, e）。
此外，研究人员对抗生素处理后的Gpihbp1-/-敲除鼠（赛业生物提供）构建HTGP模型进行B.uniformis干预（图4b），结果提示：相较于对照组小鼠，单菌干预组（B.U+HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度、炎症指标等均显著降低（图42f, g）。进一步分析发现，在Gpihbp1-/-敲除鼠中，B.uniformis同样有效抑制了中性粒细胞的募集与NETs的形成。CD45与Ly6g、CitH3与MPO免疫荧光双染证实，B.U+HTGP组胰腺组织中性粒细胞的募集与NETs形成显著减少（图4h-k）。综上，研究者发现B.uniformis可通过抑制中性粒细胞浸润及NETs形成，进而缓解HTGP。
在FMT试验中，研究人员分别对FMT-HC组与FMT-HTGP组血浆样本进行非靶向代谢组学测定，结果提示：粪便牛磺酸在FMT-HC组中表达水平升高（图5a），ELISA证实代谢组学结果（图5b），菌群-代谢相关性分析提示：B.uniformis可能通过促牛磺酸合成延缓HTGP进展（图5c）。在单菌试验中氨基酸靶向代谢组学测定，结果提示：粪便牛磺酸在B.U+HTGP组中表达水平升高（图5d），ELISA检测B.U+HTGP小鼠血浆牛磺酸水平同样高于对照组（图5e）。基于多组学研究结果，研究人员发现牛磺酸是肠道菌群缓解HTGP进展的关键代谢产物，随即验证牛磺酸在HTGP中的缓解作用（图5f）。相较于对照组（HTGP），给予HTGP小鼠牛磺酸饮用水干预周后，牛磺酸干预组（Tau+HTGP）小鼠胰腺损伤明显缓解（图5g），中性粒细胞比例表达下调（图5h），NETs形成显著减少（图5i, j）。
此外，研究人员对Gpihbp1-/-敲除鼠同样进行验证，证实牛磺酸干预组（B.U+HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度显著降低（图5k）,中性粒细胞比例表达下调（图5l），NETs形成显著减少（图5m, n）。综上，研究者发现牛磺酸是B.uniformis干预后的关键菌群代谢产物，其可能通过肠屏障进入至血循环及胰腺组织中，依赖于中性粒细胞及NETs发挥抗炎作用。
PAD4是NETs形成的关键基因，Pad4基因敲除小鼠（Pad4-/-）是公认的NETs缺陷模型。为验证牛磺酸与HTGP病程中NETs形成的直接相关性，研究者利用Pad4敲除小鼠（赛业生物提供）构建HTGP模型，并分别予以牛磺酸或无菌水分别干预，共分为HTGP、Pad4-/-+HTGP、Tau+Pad4-/-+HTGP三组（图6a）。首先，研究人员发现抑制NETs形成可明显缓解HTGP进展，而对于Pad4-/-小鼠构建的HTGP模型，牛磺酸干预并未起到明显的缓解作用（图6b-e）。此外，免疫荧光分析提示，Pad4-/-+HTGP组小鼠胰腺组织及外周血中性粒细胞的活化和NETs形成显著减轻，而对牛磺酸干预对此小鼠无明显缓解作用（图6f）。同样，研究人员提取各组小鼠外周血中性粒细胞并观察体外NETs形成印证上述结论（图6j-i）。综上，研究人员进一步利用了Pad4敲除鼠构建HTGP-NETs缺陷模型，从动物水平证实牛磺酸对于HTGP病程中NETs形成的直接抑制作用。
基于上述研究，研究人员发现B.uniformis促牛磺酸合成抑制NETs形成在HTGP中的重要作用。为进一步明确上述菌群、代谢、免疫节点在HTGP诊治中的重要临床价值，研究者收集20名健康志愿者及30名HTGP患者临床血液样本并进行相关性分析（图7a）。血清ELISA证实健康人群的NETs水平显著低于HTGP患者，同时NETs水平与HTGP严重程度成正相关；健康人群的牛磺酸水平显著高于HTGP患者，与NETs水平呈显著负相关（图7b-c），B.uniformis丰度与血清牛磺酸水平呈正相关（图7b, d）。
进一步研究发现，健康人群外周血中性粒细胞无明显NETs表现，而HTGP患者外周血可见明显NETs形成，提取HTGP患者外周血提取的PMN进行牛磺酸干预，发现HTGP+Tau组体外NETs形成明显减少（图7e）。此外，研究者提取小鼠外周血中性粒细胞，PMA体外诱导NETs形成，同时加入HC人群与HTGP患者血浆上清进行体外共培养，结果发现：相较于PMA诱导NETs形成组，健康人血清干预组NETs缓解，而HTGP患者血清干预组NETs并未缓解（图7f）。相较于PMA体外诱导NETs组，牛磺酸处理可导致中性粒细胞内磷酸化NF-κB蛋白水平显著降低（P综上，研究人员从临床样本中证实了B.uniformis、牛磺酸、NETs形成的相关性，并进一步验证了健康人血清对NETs形成的缓解作用及牛磺酸抑制NETs形成的确切机制，发掘了B.uniformis及牛磺酸在HTGP治疗中的临床价值。
研究结论
该研究发现高甘油三酯血症性胰腺炎（HTGP）患者肠道单形拟杆菌（B.uniformis）丰度下调，导致其代谢产物牛磺酸水平降低，进而通过激活NF-κB、IL-17信号通路及促进结肠IL-17释放加速胰腺中性粒细胞胞外捕获网形成（NETs），最终加剧HTGP胰腺损伤。
原文检索：
[1]Li, G., Liu, L., Lu, T. et al. Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis. Nat Commun 14, 6179 (2023).