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文献详情：
题目：肠上皮内质网应激启动嘌呤代谢物的合成，促进肠道Th17细胞的分化
杂志：Immunity.
影响因子：IF=32.4
发表时间：2023年5月
研究背景
肠上皮细胞（Intestinal epithelial cell，IECs）是将宿主与外部环境隔开的屏障。肠上皮细胞是肠道微生物和白细胞之间的界面，是第一道防线。上皮细胞具有高度分泌性，很容易受到内质网（Endoplasmic reticulum，ER）应激的影响。先前证明未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）使高分泌的上皮细胞能够维持内稳态。IECs中缺陷的UPR可促进炎症性内质网应激，导致炎症性肠病（IBD）。然而，与IEC相关的UPR对T细胞的影响和功能尚不清楚。产生白介素-17的T辅助性细胞（Th17）是肠道中CD4+ T细胞的一个重要亚型。Th17细胞通过其增强上皮屏障功能的能力来保护宿主免受致病菌和真菌的感染。肠道中的Th17细胞需要细菌的存在，并粘附于上皮细胞。然而，上皮细胞促进Th17细胞生成以响应细菌定植的机制尚不清楚。
研究思路
作者首先利用IEC-ER应激增加的Xbp1△DIEC小鼠，通过流式细胞术检测发现Th17细胞比例和细胞数量增加。接着使用SubAA272IEC小鼠，通过单细胞转录组分析，发现不同肠细胞亚型及内质网应激标记基因增加。进一步，作者使用相同的方法验证在无菌情况下，IEC中的内质网应激也能选择性地促进Th17细胞的反应。接着作者通过单细胞RNA测序分析中鉴定出的Th17细胞相关基因富集，且均未显示致病性Th17细胞特征。随后，作者通过qRT-PCR分析检查涉及Th17细胞相关基因的表达，发现Duoxa2/Duox2转录增加。作者通过非靶向质谱，发现肌苷和黄嘌呤这两个嘌呤代谢的产物高度富集，这可能与DUOXA/duox2依赖的ROS和XDH依赖的黄嘌呤有关。接着，作者使用Jac鼠和Jac-Tac鼠评估IEC-ER应激是否在肠道细菌诱导Th17细胞发挥作用。最后，作者通过两个公开的RNA-seq数据集评估了内质网应激和IL17A表达在人类肠道炎症环境中是否相互相关。（ps有问题找小薇，关注小薇，科研热点、国际前沿or创新型思路，想看啥call下小薇，咱就是说安排！）
主要结果
1. IEC内质网应激增强小鼠Th17细胞增加
作者首先利用IEC-ER应激增加的Xbp1△DIEC小鼠，通过流式细胞术检测，发现与SPF Xbp1fl/fl小鼠相比，SPF Xbp1△DIEC小鼠小肠固有层中Th17（CD45+ TCRb+ CD4+ IL17A+）细胞比例和细胞数量增加（图1A-1D）。接下来，作者通过SubAA272IEC小鼠验证，根据WB发现IRE1α和GRP78表达的升高，SubAA272IEC的小肠中内质网应激也有所增加（图1E）。作者进一步通过单细胞转录组分析，发现与对照相比，SubAA272IEC在所有簇中显示出不同比例的肠细胞亚型（图1F）和增加的内质网应激标记基因，包括Xbp1、Atf4、Hspa5和Eif2a（图1G）。这些数据表明，IEC相关的内质网应激可以影响T细胞的反应：通过删除Xbp1或用SubAA272靶向GRP78来促进Th17细胞的分化。
2. 在无菌条件下，Xbp1△DIEC小鼠体内的Th17细胞也会增加
在抗生素处理的Xbp1△DIEC小鼠中，作者也观察到高数量和百分比的Th17细胞（图2A）。然后，作者将Xbp1△DIEC小鼠重新衍生到无菌（germ-free，GF）条件中。与GF Xbp1fl/fl小鼠相比，GF Xbp1△DIEC小鼠的小肠和结肠固有层中Th17细胞的数量和百分比都有所增加（图2B）。接下来，作者通过单细胞转录组分析（图2D）发现，与GF Xbp1fl/fl小鼠相比，GF Xbp1△DIEC的小肠固有层CD4+ T细胞中，Th17细胞扩增（图2F），Th17相关基因，如IL17a、IL17f、Basp1、Tnfrsf11a、Lgmn、和Rbpj高度富集（图2G）。这些研究表明，即使没有肠道微生物，IEC中的内质网应激也能选择性地促进Th17细胞的反应。
3. 在抗生素处理和GF条件下，IEC-ER应激诱导的Th17细胞的非致病性，这一个过程需要RORgt的表达
作者将Il17a-egfp+小鼠与Xbp1△DIEC小鼠杂交。发现在抗生素处理条件下，Il17a-egfp+ Xbp1△DIEC报告小鼠的小肠中CD4+T细胞增加（图3A）。通过RNA-seq分析显示，与阴性细胞相比，Il17a-egfp+细胞中有68个基因增加（图3B）。从簇1中GF Xbp1△DIEC的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析中鉴定出的Th17细胞相关基因富集（图3C）。且均未显示先前确定的致病性Th17细胞特征（图3D和3E）。这些数据表明，在抗生素处理和GF条件下，IEC相关的内质网应激诱导的Th17细胞与非致病性基因表达特征相关。RAR相关的孤儿受体（RORgt），由Rorc编码，是驱动Th17细胞程序的主转录因子。作者将WT（Rorcfl/fl）和Rorc缺陷（Rorcfl/flxCD4Cre）幼稚CD4+ T细胞转移到Xbp1fl/flRag2-/-和Xbp1△DIECRag2-/-小鼠中，然后进行抗生素治疗（图3F），发现转录因子RORgt可能促进IEC-ER应激诱导的Th17细胞分化。
4. ER应激的IEC增加ROS的产生对Th17细胞的分化至关重要
作者进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析检查各种涉及Th17细胞上游途径基因的表达，发现GF Xbp1△DIEC小鼠中Duoxa2/Duox2转录增加（图4A）。在MODE-K细胞中诱导内质网应激也有同样结果（图4B）。DUOXA2和DUOX2在IEC膜上形成酶复合物，产生细胞外过氧化氢（H2O2）。经精氨酸处理的MODE-K细胞中过氧化氢的产生持续增加（图4C）。GF Xbp1△DIEC小鼠的小肠和结肠组织上清液中释放更多的过氧化氢（图4D）。作者用N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理GF Xbp1△DIEC小鼠，发现NAC治疗降低了GF Xbp1△DIEC的小肠和结肠中的Th17（图4E），而不影响Treg细胞（图4F）。作者使用Duoxa-/-Xbp1△DIEC小鼠进行验证Duoxa2/Duox2复合物的作用。与Duoxa+/+ Xbp1△DIEC小鼠不同，Duoxa-/-Xbp1△DIEC小鼠在小肠中没有表现出Th17细胞的数量的增加（图4G）。接下来，通过Duox2△DIECXbp1△DIEC小鼠发现Th17细胞减少（图4H）。因此，得出结论，DUOXA2/DUOX2复合物及其过氧化氢的产生对于生成IEC-ER应激诱导的Th17细胞至关重要。
5. IEC产生的嘌呤代谢物有助于Th17细胞的分化
作者通过对GF Xbp1fl/fl和GF Xbp1△DIEC小鼠的血清进行非靶向质谱（MS），发现在Xbp1△DIEC小鼠中肌苷和黄嘌呤高度富集（图5A）。此外，作者发现GF Xbp1△DIEC小鼠的小鼠结肠组织产生了更多的肌苷和腺苷（图5C）。作者通过MODE-K细胞系研究IEC-ER应激如何影响嘌呤代谢物的产生，发现与对照组MODE-K细胞相比，表达SubAA272的MODE-K细胞中嘌呤代谢相关基因的表达被强烈诱导（图5D）。这些数据表明，IEC-ER应激产生了更多的嘌呤代谢物。接着作者将别嘌呤醇用于GF Xbp1△DIEC小鼠饮用水中，别嘌呤醇治疗降低了GF Xbp1△DIEC小鼠小肠中的黄嘌呤和Th17细胞，但不影响Treg细胞（图5E-5G）。此外发现NAC处理降低了MODE-K细胞中的Xdh转录本（图5H）。与Xbp1△DIEC小鼠相比，Duox2 Xbp1△DIEC小鼠的小肠上皮细胞中Xdh转录本减少（图5I）。在IEC中Duox2的缺失（图5J）减弱了Xbp1△DIEC小鼠小肠组织中黄嘌呤产量的增加。这些数据共同表明，IEC中内质网应激通过DUOXA/duox2依赖的ROS和XDH依赖的黄嘌呤产生促进Th17细胞分化的线性途径。
6. Th17细胞诱导细菌刺激IEC中的内质网应激反应
作者使用Jac鼠和Jac-Tac鼠，发现与Jac和GF小鼠相比，Jac-Tac和Tac小鼠的内质网应激标记基因的表达分别增加（图6a、6B）。同时发现在Jac-Tac和Tac小鼠的小肠中，Duoxa2/Duox2的表达增加和过氧化氢的产生（图6C）。然后，作者用4-苯基丁酸（4-PBA）处理Tac小鼠，发现降低了Tac小鼠小肠中的Th17细胞，但不影响Treg细胞或Th2细胞（图6D-6F）。别嘌呤醇治疗对Tac小鼠小肠中的CD4亚群有与4-PBA相似的作用（图6G-6I）。这些数据表明，内质网应激和嘌呤代谢物参与了共生细菌诱导的B6小鼠Th17细胞的分化。作者使用Cr-wt和Cr-△eae小鼠。发现Cr-wt小鼠而非Cr-△eae小鼠表现出Th17细胞诱导（图6J），并发现Cr-wt小鼠结肠中IRE1a和GRP78的表达增加（图6K），Duoxa2/Duox2转录本增加和过氧化氢的产生增加（图6L）。此外，4-PBA治疗导致Th17细胞减少（图6M-6P）。总之，研究结果表明了内质网应激对由IEC粘附的共生菌和致病菌诱导Th17细胞的调节作用。
7. IBD患者内质网应激信号与Th17细胞相关基因表达呈正相关
最后，作者通过两个公开的RNA-seq数据集发现与在小鼠模型中观察到的结果一致，IL17A、内质网应激（HSPA5）、DUOX2，DUOXA2和嘌呤代谢相关（PNP，XDH）基因在UC和CD（图7A）患者中增加，在UC和CD中显著相关（图7B）。这些数据表明，内质网应激、ROS和嘌呤代谢可能是人类IBD患者Th17反应的基础。
文章小结
该研究通过多种小鼠模型探索肠上皮细胞和Th17细胞之间的关系，并从内质网应激、嘌呤代谢、肠道菌群来探索其具体机制。了解人类IBD相关的Th17细胞是否与发现的IEC-ER应激诱导的Th17细胞重叠，将是未来研究的重要方向。这也为探索其他器官中上皮细胞和适应性免疫细胞之间的对话提供新的思考。该文章整体逻辑清晰、环环相扣！感兴趣的小伙伴们快来看看吧！
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