在工作中遇到的蛋白通常都不是常规的抗体，经常是一段蛋白结构域通过连接体连接了Fc等的融合蛋白。而连接体在融合蛋白中起的作用，以及如何选择连接体都是一门学问。这里搜到一篇综述文献，和大家分享。
作为DNA重组技术的产物，融合蛋白已经被开发为一类具有多功能特性的新型生物大分子。通过将两个或两个以上的蛋白结构域进行融合，可以获得多种不同的功能，也是现在双抗及多抗实现的一种重要形式。现在上市的好多蛋白药物都是融合蛋白，例如1998年上市的依那西普，2005年上市的阿巴西普，2008年上市的罗米司亭，2014年上市的度拉糖肽等。
重组融合蛋白的成功构建需要两个不可或缺的要素：组成蛋白和连接体。组成蛋白的选择基于融合蛋白产物的预期功能，可以是细胞因子，治疗性配体、酶等。没有连接体的蛋白功能域直接融合可能会导致许多不良后果，例如导致融合蛋白错误折叠、蛋白产量降低或者生物活性降低。因此，选择或合理设计连接融合蛋白的连接体是很重要的。
重组融合蛋白连接体的分类
研究人员通过对天然多域蛋白质连接体的分析，发现了许多可以用于蛋白融合的候选连接体。此外，还设计了许多具有不同序列和构象的经验连接体，用于构建重组融合蛋白。现在常用的经验连接体可以分为三类：柔性连接体、刚性连接体和可裂解连接体。
柔性连接体
当连接的蛋白结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常需要使用柔性连接体。柔性连接体一般由小的非极性(如Gly)或极性(如Ser或Thr)氨基酸组成。这些氨基酸的小尺寸提供了灵活性，并使连接的蛋白功能域具有一定的移动能力。加入Ser或Thr可通过与水分子形成氢键来保持连接体在水溶液中的稳定性，从而减少连接体与蛋白功能域之间的不利相互作用。
最常用的柔性连接体主要有以下序列，由Gly和Ser组成，例如(G4S)n。通过调整n的大小，可以优化G4S连接体的长度，已实现蛋白功能域的适当分离或保持必要的域间相互作用。
使用柔性连接体常会带来额外的翻译后修饰，例如之前推文提到的O-xyl(蛋白药物中花样繁多的O-糖基化修饰)，磷酸化等。因此在这类融合蛋白的质控中需要特别注意。
刚性连接体
虽然柔性连接体赋予了蛋白功能域一定的灵活性，但是这有时候也是一种限制。例如，连接的两个蛋白结构域没有被充分的分离开，或者没有充分减少他们之间的相互干扰。这种情况下，就需要刚性的连接体来保持蛋白结构域之间的固定以保持他们的独立功能不被干扰。
(EAAAK)n的α螺旋连接体已被用于构建许多重组融合蛋白。另一类刚性连接体是富含P的序列(XP)n，其中X是可以使任意氨基酸，推荐的是Ala，Lys或Glu。常用的刚性连接体是(AP)n。
可裂解连接体
上面讨论的两种连接体一般都是由抗酶切的多肽组成，在体内不会被优先裂解。这些稳定的连接体将蛋白功能域共价连接在一起，在踢被过程中作为一个完整分子发挥作用。这种稳定连接有许多功能，如延长血浆半衰期(白蛋白或Fc融合)。然而，这也存在一些潜在的缺点，包括功能域之间的空间位阻、生物活性降低以及由于功能域之间的干扰而改变蛋白的PK。在这种情况下，研究人员引入了可裂解连接体，以在体内释放自由的功能域。这类连接体在融合蛋白中较少见。
连接体设计工具及数据库
对于天然结构域蛋白和重组融合蛋白中连接体的广泛研究促进了建立数据库和开发连接体设计工具的想法，以帮助根据融合蛋白所需的特性按理性设计连接体。
现有的连接体设计的工具有LINKER，该工具可以根据用户指定的输入(如连接体长度，需要避免蛋白酶敏感序列)搜索连接体序列数据库，并生成符合标准的若干连接体序列输出。连接体序列数据库存在14734条序列。
阿姆斯特丹自由大学的综合信息学中心提供了一个网页版的连接体数据库，可以用于连接体序列的搜索(http://www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww/)。这一搜索算法支持多种查询类型，如PDB代码、PDB标头、连接体长度等。
融合蛋白中连接体功能
重组融合蛋白中连接体的最基本的功能是共价连接蛋白功能域。在蛋白质药物设计中，连接体还能提供许多额外功能，如提高生物活性、增加产量、实现可控或靶向给药，以及获得理想的药代动力学结果。
提高生物活性
连接体的插入适当改变了不同蛋白结构域间的距离，以减少他们之间的相互影响，恢复或改善折叠，最终提高生物活性。例如，将HSA与IFN-α2b组成的融合蛋白可以广泛延长蛋白质药物的血浆半衰期和提高体内药效。而用于HSA与IFN-α2b的直接融合会降低IFN-α2b的抗病毒活性，因此有三种类型连接体，包括柔性连接体（G4S），刚性富P连接体（PAPAP）和刚性螺旋连接体（AEAAAKEAAAKA）。使用这三种连接体，抗病毒活性与未使用连接体融合蛋白相比，分贝提高了39%、68%和115%。连接体的插入还有效的促进了融合蛋白的正确折叠。
连接体影响融合蛋白PK
尽管已经有多种融合蛋白药物上市，双功能融合蛋白的PK机理仍未研究透彻。对于传统的蛋白药物来说，其PK过程相对简单，即蛋白与细胞表面受体结合引起内吞和溶酶体降解。而双功能及多功能融合蛋白的PK受不同结构域/结合位点的影响，其PK特征要复杂的多。而由于连接体的插入可能会改变每个蛋白结构域的受体亲和力，因此会影响融合蛋白的清除，增加PK研究的复杂性。下表列举了两个融合蛋白，使用不同的连接体，产生了不同的药效及半衰期。
总结
在开发治疗性重组融合蛋白的过程中，连接体设计已经成为实现产品所需特性的重要手段。选择最佳的连接体可为融合蛋白的研发和生产提供许多的优势，包括提高蛋白稳定性、增强生物活性、提高产量及药物的半衰期等。
参考文献
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