l 题目： 多形性胶质母细胞瘤预测预后的T细胞耗竭相关基因标记的鉴定
l 杂志：Journal of Cellular and Molecular Medicine
l 影响因子：IF=5.3
l 发表时间：2023年8月
研究背景
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是一种高度恶性的原发性脑肿瘤，在成人中预后较差。T细胞耗竭(TEX)是一种T细胞功能障碍的状态，其特征是效应细胞功能差，受体表达持续抑制，转录状态改变。T细胞耗竭在不同肿瘤类型的预后和治疗效果中的重要性日益凸显，但从TEX中获得预测GBM预后的简单而强大的基因标记尚未得到详细探索。
数据来源
研究思路
基于公共数据库下载GBM队列，使用R软件包“ConsensusClusterPlus”进行一致聚类分析以识别潜在亚型，使用R软件包“limma”对两个亚组之间的mRNA、lncRNA和miRNA进行差异表达分析。microRNA-target关系从miRTarBase数据库中获得。对靶点mRNA的功能富集分析用于注释miRNA的功能。计算mRNA与lncRNA之间的Pearson相关系数，鉴定lncRNA共表达mRNA，并对lncRNA共表达mRNA进行功能富集分析。使用CIBERSORT、 xCell、 EPIC31和MCP-counter.对肿瘤浸润性免疫细胞和肿瘤免疫微环境进行估计。采用单因素和多因素Cox比例风险回归分析来评估基因与总生存率之间的关系。使用R软件包“stats”对这些预后基因以逐步选择法进行特征选择。通过多因素Cox回归分析，构建风险评分模型。最后通过外部队列(CGGA、GSE7696)进一步验证预后风险模型的准确性。
主要结果
1 TEX相关基因的转录图谱揭示了GBM患者的异质性亚群
本研究从先前的研究中收集了563个与TEX相关的基因为了探索TEX在GBM中的异质性。本研究基于563个TEX相关基因的表达水平进行了共识聚类，并确定了两个聚类，这里称为TEX- C1和TEX- C2(图1A,B)。如图1C所示，生存分析显示，TEX-C2组患者预后优于TEX-C1组患者(HR = 0.617, 95% CI 0.437-0.870;log-rank p = 0.006)(图1C)。此外，TEX-C2组的1年和3年生存率分别为69.8%和13.9%，而TEX-C1组的相应生存率分别为47.2%和4.2%。为了检验TEX簇与T细胞活性状态之间的关联，本研究进行了ssGSEA分析，比较了TEX- C1和TEX- C2簇之间7条T细胞相关通路的活性状态。结果发现，TEX-C1和TEX-C2簇之间的T细胞活性状态存在显著差异。如图1D所示，与TEX-C2簇相比，TEX-C1簇中所有7条T细胞相关通路的富集分数明显更高。这些发现表明，T细胞活性状态与生存结果相关，高风险组具有激活的T细胞活性状态，而低风险组具有严重的T细胞耗竭。
2 基于TEX亚型的肿瘤免疫微环分析
为了进一步探讨肿瘤免疫微环境的异质性，本研究首先使用CIBERSORT、xCell、EPIC和MCP-counter来估计肿瘤免疫微环境中浸润免疫细胞的丰度。两种基于TEX亚型之间的免疫细胞浸润水平如图2A所示。估计免疫细胞浸润水平在TEX-C1亚型高于TEX-C2亚型。进一步分析发现，TEX-C1亚型的免疫评分、免疫微环境评分和基质评分均明显高于TEX-C2亚型(图2B)。此外，本研究还比较了两种基于TEX亚型之间四个免疫检查点的表达水平，结果发现TEX-C1亚型中四个免疫检查点(PD1、PD-L1、CTLA4和TIM3)的表达明显高于TEX-C2亚型(图2C)。
3 基于TEX亚型的多维分子特征
为了确定与TEX相关亚群的分子特征，本研究首先研究了两个TEX相关亚型之间的基因组变异模式。突变分析显示，在TEX-C1亚型中未观察到1、2、5、7、10、11、12、16和17号染色体上的突变，而TEX-C1亚型的突变主要集中在18和X染色体上(图3A)。总的来说，TEX-C2亚型的突变数量明显高于TEX-C1亚型。拷贝数变异分析显示，两种TEX相关亚型的拷贝数变异存在差异(图3B)。
接下来，本研究对TEX-C1和TEX-C2集群之间的三个分子层(mRNA, miRNA, lncRNA)进行了差异表达分析。本研究确定了170个mRNA在TEX-C1集群中上调，86个mRNA在TEX-C2集群中上调(图3C)。功能富集分析表明，在TEX-C1簇中上调的基因倾向于富集免疫应答和信号转导，而在TEX-C2簇中上调的基因倾向于富集细胞命运和神经系统发育(图3D)。对于lncRNA, TEX-C1集群中有301个lncRNA上调，TEX-C2集群中有369个lncRNA上调(图3E)。为了探索这些lncRNA的功能作用，本研究通过计算Pearson相关系数对mRNA和370个lncRNA进行了共表达分析。对与lncRNA共表达的mRNA进行功能富集分析发现，在TEX-C1簇中上调的lncRNA倾向于富集免疫调控，包括肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生调控、白细胞分化调控和T细胞活化调控，而在TEX-C2簇中上调的lncRNA倾向于富集神经系统发育(图3F)。对于miRNA，本研究在TEX-C1集群中发现了9个过表达的miRNA，在TEX-C2集群中发现了54个过表达的miRNA(图3G)。并且发现在TEX-C2中上调的miRNA富集于卵母细胞发育和核糖核酸内切酶活性、切割的调控，而在TEX-C1中上调的miRNA富集于RNA代谢过程和Wnt信号通路的调控(图3H)。
4 TEX相关特征的识别和发展，以预测生存结果
本研究对563个TEX基因与总生存时间进行了单因素Cox比例风险回归分析。结果发现563个TEX相关基因中有101个与总生存率显著相关(p < 0.05)。随后对101个预后相关基因与临床变量(性别和年龄)进行多因素Cox比例风险回归分析，发现101个预后基因中有27个保留其预后意义(p < 0.05)。为了确定构建预测模型的最佳基因组合，本研究采用逐步选择法对27个独立预后的TEX相关基因进行了特征选择，筛选出了预测能力最显著的12个TEX基因组合(CD79B、CKAP4、DUSP5、MTHFD2、OGFR、SPON2、BANK1、CXCL1、CCL2、CXCL6、DRAM1和LITAF)。其中，与HR < 1相关的4个基因(MTHFD2、SPON2、CXCL1和DRAM1)可能是保护因子，其高表达与较长的总生存期密切相关，而其余6个基因(CD79B、CKAP4、DUSP5、OGFR、BANK1、CCL2、CXCL6和LITAF)往往是危险的预后因子，其高表达与较短的总生存期相关(图4A)。
随后，本研究根据12个TEX基因的表达，进行多因素Cox回归分析，建TEX相关基因标记的风险评分模型(简称12TexSig)，风险评分模型的公式为：12TexSig = CD79B表达值*0.6062 + CKAP4表达值*0.4571 + DUSP5表达值*0.5388 + MTHFD2表达值*(−0.4966)OGFR表达值*0.3333 + SPON2表达值*(−0.6398)+ BANK1表达值*0.2769 + CXCL1表达值*(−0.2418)+ CCL2表达值*0.3836 + CXCL6表达值*0.3741 + DRAM1表达值*(−0.8747)+ LITAF表达值*0.5239。此外，本研究构建了预测1、3和5年生存率的nomogram图(图4B)。使用风险评分模型，计算TCGA队列中每个患者的风险评分。根据最佳风险临界值将TCGA队列的所有患者分为高危组(n = 102)和低危组(n = 65)。12TexSig的风险评分、基因表达谱和生存状态分布如图4C所示。生存分析显示，高危组患者总生存期明显短于低危组患者(HR = 0.282, 95% CI: 0.186 ~ 0.424; p < 0.001)(图4D)。多因素分析结果显示，经年龄和性别调整后，预后模型与总生存率显著相关(HR = 2.642, 95% CI :2.069-3.373; p < 0.001)(图4E)。
5 预后风险模型的验证
为了测试预后模型的稳健性，本研究检查了12TexSig在两个外部队列中的预后价值。首先测试了12TexSig在CGGA队列中的预后价值，其中12TexSig将693个样本分为高风险和低风险组，生存率有显著差异。12TexSig的风险评分、基因表达谱及生存状态分布如图5A所示。高危组患者的总生存率显著低于低危组(log-rank p < 0.001)(图5B)。此外，将12TexSig应用于GSE7696队列时，本研究计算了GSE7696队列中每个患者的风险评分，并将80个样本分为高风险组(n = 43)和低风险组(n = 37)。预后模型的风险评分、基因表达谱和生存状态分布如图5C所示。与TCGA队列中描述的结果一致，高风险组和低风险组的患者表现出明显不同的生存状态。高危组患者的生存时间短于低危组患者(log-rank p = 0.087)(图5D)。
文章小结