摘要
作者通过单细胞（scRNA）结合空间（Spatial transcriptome，ST）转录组测序技术综合地探索原发结直肠癌（CRC）及肝转移CRC（CRCLM）的细胞图谱的转录水平的差异，从27个样本（取自6名CRC患者）中得到41,892个CD45-非免疫细胞及196,473个CD45+免疫细胞。经分析作者发现呈现出高增殖能力和肿瘤激活特征的肝转移样本的CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群显著增加，有助于患者有更好的预后；富集在原发肿瘤中的F3+成纤维细胞通过表达促肿瘤辅助因子导致总生存期更差，但是富集在肝转移肿瘤中的MCAM+成纤维细胞能够通过Notch信号促进CD8_CXCL13细胞的产生。
研究背景
在全球范围内结直肠癌（CRC）是第三大最常见的恶性肿瘤，约21~26%的患者会发生同步转移疾病，其中14.5~17.5%的患者会发生肝转移。转移的CRC往往预后很差，CRCLM导致巨大的临床挑战。转移过程是个多步骤事件，而癌细胞和基质细胞之间能够通过分泌可重塑肿瘤微环境（TME）的细胞因子、生长因子和蛋白酶进行通讯，从而促进转移性扩散。TME的细胞组成非常复杂，包含不同的成纤维细胞群体及免疫细胞，这些细胞在肿瘤逃避、转移及响应治疗中发挥重要功能。已有研究在多种肿瘤中鉴定到一些癌相关成纤维细胞（CAF）的亚型，既有促癌的亚型又有抗癌的亚型（通过活化CD4+ T细胞）。肿瘤免疫微环境（TIME）由多种淋巴及髓系细胞组成，而CD8+ T细胞已被证明是抗肿瘤免疫反应中强大的“战士”，实体瘤中CD8+ T细胞浸润则预示着良好的预后。尽管原发CRC免疫环境已经被报道了，但CRCLM的细胞图谱及原发和转移CRC之间的通讯网络的差异却鲜有报道。因此作者通过scRNA联合ST描绘了CRC和肝转移的高分辨率细胞图谱，为未来的癌症治疗提供潜在的靶点。
研究结果
1. CRC原发肿瘤和肝转移性CRC肿瘤的全局scRNA图谱
作者收集了6名CRC患者的原发结直肠肿瘤（CC）、邻近正常结肠黏膜（CN）、肝转移（LM）、邻近正常肝组织（LN）以及外周血（PB）共27个样本的CD45-非免疫细胞及CD45+免疫细胞用于scRNA分析（图1A）。经质控过滤，作者鉴定到41,892个CD45-非免疫细胞及196,473个CD45+免疫细胞。将非免疫细胞聚类为11个肿瘤细胞群、8个成纤维细胞群、6个内皮细胞群（图1B）。作者发现CA2和F2_MCAM富集在LM中，但F4_F3和F5_CCL11则显著富集在CC（图1C）。基于已知marke基因的表达，免疫细胞被分成41个群（图1D）。在原发性TME中，调节性T细胞（Tregs）和巨噬细胞较之CN组更多。尽管LN组中单核、NK细胞、MAIT细胞占主导地位，但在肿瘤细胞转移后TIME会被重塑，Tregs和巨噬细胞则显著上调（图1E）。综上所述，作者在CRCLM的不同组织中鉴定到了具有不同分布模式的多个细胞群。
图1. 肝转移性CRC的全局细胞景观
（A）实验设计和分析流程图
（B）非免疫细胞群的UMAP可视化
（C）非免疫细胞群相对丰度（CC vs LM，n=5）
（D）免疫细胞群的UMAP可视化
（E）免疫细胞群相对丰度（肿瘤vs癌旁，n=6）
2. CRC原发肿瘤和肝转移CRC肿瘤的空间分布图谱
作者收集了6名患者的原发肿瘤和肝转移肿瘤（包含4例CRC原发肿瘤（C1到C4）及2例肝转移肿瘤（L1和L2））便于综合分析原发CRC和转移CRC的空间分布。作者通过HE染色和每个样本的基因表达特征来区分肿瘤区域（T）和癌旁区域（PT）（图2A）。与癌旁组织相比，肿瘤组织富集了与细胞周期相关的通路，如G2-M检查点，E2F靶点和有丝分裂纺锤体（图2B）。根据基因表达图谱，肿瘤组织和癌旁组织被分为不同的区域（图2A）。考虑到每个spot含有多个细胞，作者应用signature-based策略整合ST和scRNA数据去评估每个捕获的spot的细胞类型，细胞类型的打分及比例分布在每个区域。作者观察到C1、C3和C4的肿瘤组织的浆细胞与癌旁的浆细胞比较是减少了的（图2C和D）。
图2. 空间转录组样本的细胞鉴定
（A）空间转录组切片概览
（B）每个切片中肿瘤组织和癌旁组织hallmarker基因的富集打分
（C）原发CRC切片与scRNA数据联合分析鉴定cluster；左：SPOTlight解卷积展示每个spot中细胞类型百分比；中：定义丰度最高的细胞类型为每个spot的细胞类型；右：不同区域细胞类型百分比，代表每个区域中所有spots的细胞类型的百分比
（D）肝转移切片的与scRNA数据联合分析鉴定cluster
3. TME重塑了髓系细胞的组成
在TME中髓系细胞是异质性亚群，作者鉴定到3种髓系细胞：单核/巨噬、DCs和Mast细胞。通过进一步分亚群，作者鉴定到8个单核/巨噬群，3个常规的DCs（cDCs）群（图3A）。每个位点的髓系细胞有不同的分布模式（图3B），表明了器官特异的特征。与癌旁相比，Mac_SPP1亚群富集在肿瘤中，并且Mac_SPP1亚群中的大多数细胞都来自原发肿瘤。此外，LM中高表达CXCL9的Mac_CXCL9亚群比例显著上升（图3C），表明这个亚型可能会将CXCR3阳性的效应T细胞招募到肿瘤中。参与招募髓系细胞特别是粒细胞的基因，如CXCL3，富集在Mac_SPP1亚群中（图3D）。髓系来源的抑制性细胞能够表达高水平的CXCR2，是CXCL3的受体且会通过表达精氨酸酶和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制CD8+ T细胞。GSVA分析显示Mac_SPP1亚群参与了与炎症反应相关的途径。然而Mac_CXCL9亚群富集在干扰素-γ（IFN-γ）响应和T细胞活化通路（图3E）。轨迹分析显示Mac_CXCL9和Mac_SPP1亚群都是终末分化，表明它们是肿瘤活化的亚群（图3F）。
根据细胞因子的表达和功能可将DCs分为pDCs和cDCs。之前的研究显示在TME中鉴定到cDC1和cDC2，本文数据显示在CC和LM中鉴定到cDC1（cDC_CPNE3）和cDC2（cDC_CD1c）（图3A）。此外，cDC_LAMP3也被鉴定到且富集在LM（图3C）。cDC_LAMP3表达高水平的CCR7，CCR7是CCL19和CCL21的受体，说明它有迁移到淋巴结的能力。另外，cDC_LAMP3亚群呈现出高表达水平的共刺激分子CD40、CD80和CD86（均为DC成熟的marker）（图3H）。在LM中cDC_LAMP3亚群的百分比显著增加，表明肿瘤细胞对TIME的影响。
图3. 髓系细胞免疫景观
（A）髓系细胞群的UMAP可视化
（B）CN、CC、LN、LM和PB中髓系细胞群的百分比
（C）髓系细胞中MAC_SPP1、MAC_CXCL9和cDC_LAMP3亚群的百分比
（D）MAC_CXCL9和MAC_SPP1亚群之间差异表达基因
（E）富集在MAC_CXCL9和MAC_SPP1亚群的信号通路的GSVA分析
（F）髓系细胞发育轨迹分析（Monocle）
（G）髓系细胞中LAMP3和CCR7的表达
（H）髓系细胞中CD40、CD80和CD86的表达
4. CXCL13+ T细胞富集于肝转移肿瘤
适应性免疫应答中的T细胞，特别是CD8+ T细胞和CD4+ T细胞占主导地位。作者鉴定出7个CD8+ T细胞群，5个经典CD4+ T细胞群（cCD4）和2个Tregs群。CD8+ T细胞和CD4+ T细胞都包含一个表达CXCL13（CXCR5的趋化因子）的群（图4A和B）。与LN相比，LM中CD8_CXCL13细胞的百分比显著增加，但是这个亚群在CN、LN及PB中非常稀有（图4C和D）。在结肠的稳定状态下，大约3~12%的CD4细胞是CXCL13阳性的，记为卵泡辅助T细胞（TFH）。在CC中，CD4_CXCL13的百分比是下降的，但是与LN相比LM中的这个亚群比例又在增加（图4E）。
为了进一步探索CXCL13+ T细胞亚群的特征，作者分析了每个亚群中上调的通路。GSVA分析发现CD8_CXCL13亚群富集在T细胞增殖的信号通路，CD4_CXCL13富集在G2-M检查点信号通路，两个亚群都展示了增殖特性（图4F和G）。每个亚群的基因分析发现CD8_CXCL13高表达组织驻留记忆T细胞（TRM）的marker基因ITGAE。考虑到TRM细胞也是CD69+的，作者通过流式细胞术鉴定了CD69+CD103+CD8+ T细胞。多数CD103+细胞是CD69阳性细胞，但CD69+CD103+CD8+ T细胞在LN中又很稀有。CC和LM中的CD69+CD103+CD8+ T细胞中Ki67的表达水平高于其它CD8+ T细胞。但是CN和LN的不同的CD8+ T细胞亚群的增殖特性几乎相同（图4H）。综上所述，CRC的LM中的CD8_CXCL13和CD4_CXCL13由于它们自身的增殖能力而上调。
图4. 肿瘤浸润T细胞的转录重编程
（A）CN、CC、LN、LM和PB中CD8+ T细胞百分比
（B）CN、CC、LN、LM和PB中CD4+ T细胞百分比
（C）癌组织和癌旁组织（n=6）T细胞群的相对丰度
（D）CD8+ T细胞中CD8_CXCL13亚群百分比
（E）CD4+ T细胞中CD4_CXCL13亚群百分比
（F）GSVA通路分析CD8+ T细胞群
（G）GSVA通路分析CD4+ T细胞群
（H）流式细胞术分析CN、CC、LN、LM中不同细胞亚群Ki67的表达水平
5. CXCL13+ T细胞与CRC患者的良好预后相关
在前述结果中作者指与CD4_CXCL13亚群比较CD8_CXCL13亚群富集在CC和LM中，表明CD8_CXCL13可能是肿瘤激活亚群。因此作者进一步探索CD8_CXCL13亚群的特征。与其他亚群相比，高水平的耗竭marker，如PDCD1、HAVCR2、LAG3、CTLA4和TIGIT，均能在CD8_CXCL13观察到（图5A和B）。以往的研究指出由于持续性肿瘤抗原刺激肿瘤反应T细胞会呈现出耗竭表型，同时耗竭表型表明了它们的肿瘤反应性。轨迹分析发现CD8_CXCL13是终末分化（图5C）。此外，TME中的CXCL13+ T细胞亚群展现出显著的克隆扩展能力，进一步表明它们的抗原经验特性。另外，CD8_CXCL13亚群也表达高水平的效应分子，如GZMB（图5A和B），表明这个亚型可能会保留部分抗肿瘤功能。由于很难在组织中检测到CXCL13，作者尝试用CD69和CD103去标记CXCL13+细胞，免疫组化结果显示CD69+CD103+CD8+ T细胞更接近CK19+肿瘤细胞而不是肿瘤组织中的其它CD8+ T细胞（图5D和E），以便于它们的肿瘤杀伤功能。值得注意的是CD103+CD8+ T细胞存在于CRC组织的三级淋巴结构（TLSs），具有高TLS打分的患者会有更高的CD8_CXCL13打分，也就表明这个亚群可能参与了TLS的形成（图5F和G）。
为了探索CRC中CXCL13+ T细胞的预后价值，作者将GEO队列中的CRC患者分为CXCL13high和CXCL13low两组，发现CC中CXCL13高表达能够预测到更好的总生存期（图5H）。综上所述，富集在TME的CXCL13+ T细胞是肿瘤反应性亚群，有助于CRC患者更好的预后。
图5. CXCL13+ T细胞的特征和预后反应
（A）CD8_CXCL13和其它CD8+ T细胞之间差异表达基因
（B）CD8+ T细胞中检查点和效应分子的特征图
（C）CD8+ T细胞发育轨迹分析（Monocle）
（D）代表性CRC肿瘤CD69+CD103+CD8+ T细胞多色免疫组化染色
（E）CD69+CD103+CD8+ T细胞和CD8+ T细胞与肿瘤细胞的距离
（F）CRC三级淋巴结构中CD103+CD8+ T细胞多色免疫组化染色
（G）三级淋巴结构打分和CD8_CXCL13浸润打分的关系（GSE39582）
（H）CXCL13high和CXCL13low患者总生存期（GSE39582）
6. 成纤维细胞的不同亚群存在于原发和肝转移CRC肿瘤中
成纤维细胞是TME中主要的基质非免疫细胞类型。在许多肿瘤中已经鉴定到各种各样的成纤维细胞亚型。作者进一步表征成纤维细胞去探索CRC原发和肝转移肿瘤的异质性。通过基因表达模式的差异在CRC的TME中鉴定出8种成纤维细胞群，分别是F1_PRELP、F2_MCAM、F3_HAS1、F4_F3、F5_CCL11、F6_IGFL2、F7_COCH和F8_MKI67（图6A），所有的成纤维细胞都高表达ACTA2（CAF的重要marker）。与CC相比，LM中的F2_MCAM群的比例更高。F4_F3、F5_CCL11群包含最多来自CC的细胞（图6B）。根据bulk转录组数据来看，CC中的F4_F3浸润高于CN。然而，F5_CCL11群在CC中却减少了，依据拟时分析来看可能会逆转为F4_F3（图6C）。拟时分析同样预测到F2_MCAM和F4_F3是终末分化群（图6C）。免疫组化验证了F2_MCAM存在于CC和LM（图6D），且显示LN中的MCAM+ CAF非常稀少。与scRNA数据一致的是，F4_F3亚群仅存在于CC而不在LM中，这种现象可能是由于LN中不存在F4_F3而CN中存在F4_F3所导致的（图6E和F）。ST分析同样可以确定与LM相比CC中存在更多的F4_F3浸润（图6G和H）。在CN和CC中F4_F3亚群紧密地围绕着上皮细胞，促进其与上皮细胞的交互（图6I）。此外，CC中增加的F4_F3亚群浸润可能会导致更差的预后（图6J）。综上所述，在原发和肝转移CRC肿瘤中能观察到不同的表型图谱和高变的成纤维细胞频率，表明不同癌症情况中TMEs的细胞异质性。
图6. 原发和转移肿瘤中转录组特征及成纤维细胞的异质性
（A）成纤维细胞群的UMAP可视化
（B）CC和LM中F2_MCAM、F4_F3、F5_CCL11群的百分比
（C）成纤维细胞的发育轨迹分析（Monocle）
（D）CC和LM中F2_MCAM的免疫组化染色
（E）CC和LM中F4_F3的免疫组化染色
（F）CN和LN中F4_F3的免疫组化染色
（G）ST的CC（C1到C4）的F4_F3成纤维细胞的分布
（H）ST的LM（L1和L2）的F4_F3成纤维细胞的分布
（I）F4_F3成纤维细胞和肿瘤细胞（CK19）的多色免疫组化染色
（J）F3high和F3low患者的总生存期（GSE39582数据）
7. 富集在原发肿瘤的F3表达成纤维细胞亚群分泌促肿瘤因子，与CRC患者不良预后相关
为了研究由富集在CC和LM的不同的成纤维细胞的TME的重塑，作者进一步分析了F2_MCAM和F4_F3。F2_MCAM富含JAG1和NOTCH3，参与NOTCH信号通路。F4_F3亚群富集了C3和CXCL1，表明该亚群参与补体和炎症反应通路；同时F4_F3高表达MMP2和MMP3，可能有助于细胞外基质形成（图7A和B）。此外参与血管生成和肿瘤侵袭的促瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2也富集在F4_F3亚群（图7C）。F4_F3和肿瘤细胞的通讯分析进一步揭示了它们通过NRG1和Erb-B2受体激酶3（ERBB3）通路而进行的通讯，而ERBB3几乎全部富集在肿瘤细胞中并可与ERBB2形成异源二聚体从而促进CRC患者肿瘤细胞的增殖和西妥昔单的抗耐药性（图7D）。ST分析同样表明F3和NRG1的共定位，包围了ERBB3+肿瘤细胞。转板迁移测定法表明重组人类NRG1（rNRG1）能够促进RKO和SW620细胞的迁移（图7J）。高表达F3和NRG1的CRC患者的总生存其更差（图7K）。综上所述，富含CC的成纤维细胞F4_F3可能通过分泌促肿瘤因子导致CRC患者预后不良。
图7. F3+成纤维细胞的特征及预后反应
（A）F2_MCAM和F4_F3差异表达基因
（B）GSVA分析F2_MCAM和F4_F3亚群富集的通路
（C）成纤维细胞中VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2的表达
（D）肿瘤细胞和F4_F3成纤维细胞的通讯网络（CellPhone DB）
（E）C1样本中NRG1和ERBB3的分布
（F）C2样本中NRG1和ERBB3的分布
（G）C3样本中NRG1和ERBB3的分布
（H）C4样本中NRG1和ERBB3的分布
（I）NRG1和ERBB3的皮尔森相关性
（J）rBRG1对RKO细胞迁移的影响
（K）F3highNRG1high和F3lowRG1lowCRC患者的总生存期（GSE39582数据）
8. LM中TME中的表达MCAM的成纤维细胞通过Notch信号通路调节CD8_CXCL13细胞的形成
Notch信号TF RBPJ主要在CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群中表达（图5A）。Notch信号通路能够被配受体相互作用所激活，通过与配体的相互作用，Notch的胞外结构域被剪切，转位进入细胞核，从而调控靶基因的转录。LM中的RBPJ表达与CXCL13和ITGAE呈正相关，但是这种现象并未在CC中观察到（图8A）。CD8_CXCL13和CD4_CXCL13主要表达NOTCH受体（图7B）。为了进一步确定哪种亚群可以调控Notch信号，作者分析了Notch配体（包括DLL1、DLL3、DLL4、JAG1和JAG2）的表达水平，发现Notch配体主要表达在成纤维细胞和内皮细胞中。F2_MCAM亚群富集了JAG1，F5_COCH亚群富集DLL1，但E2_DLL4亚群富集DLL4、JAG1和JAG2（图8C）。采用CellPhone DB分析Notch和其配体的相互作用表明在内皮细胞中E2_DLL4亚群呈现出与CXCL13+ T细胞的强相互作用，在成纤维细胞中F2_MCAM亚群通过JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群相互作用（图8D）。由于成纤维细胞在TME中的散点分布模式，作者猜测F2_MCAM亚群促进了CXCL13+ T细胞中Notch信号的激活。
接着作者根据LM中F2_MCAM的比例将患者分为两组，发现F2_MCAM-high组患者在LM中有更高比例的CD8_CXCL13（图8E）。GEO数据集分析表明高F2_MCAM浸润打分的患者在LM中有更高的CD8_CXCL13的浸润打分，但在CC中并不是如此（图8F）。此外通过ST检测到LM中F2_MCAM和CD8_CXCL13位置信息，与scRNA结果一致，在ST样本中同样高F2_MCAM浸润打分伴随高CD8_CXCL13的浸润打分（图8G和H）。
已有报道表明Notch信号通路调节CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫，但Notch信号通路能否调节CXCL13的表达知之甚少。作者用JASPAR预测RBPJ在CXCL13启动子上的结合位点，表明RBPJ可能作为TF影响CXCL13的表达。
图8. TME中NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的形成
（A）LM内CXCL13、ITGAE和RBPJ的相互作用散点图（GSE50760数据集）
（B）T细胞群中NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4的表达
（C）非免疫细胞群中DLL1、DLL3、DLL4、JAG1和JAG2的表达
（D）CD8_CXCL13群与非免疫细胞之间Notch信号通路的通讯网络（CellPhone DB）
（E）LM中F2_MCAM high和low浸润分组中CD8_CXCL13的百分比（scRNA数据）
（F）LM中F2_MCAM high和low浸润分组中CD8_CXCL13浸润打分（GSE50760数据）
（G）ST中L1和L2的F2_MCAM和CD8_CXCL13的浸润打分
（H）L1和L2中CD8_CXCL13和F2_MCAM特征打分的皮尔森相关性
9. ST组织中细胞间通讯网络
作者分析了原发肿瘤和肝转移肿瘤的ST中不同群之间的细胞通讯，结果表明VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配受体对在两种情况下都富集。并且在CC和LM之间存在多种不同的配受体对。ERBB3-NRG1对主要富集在C1和C3，但在L1和L2中并不存在（图9A），表明ERBB3-NRG1通讯在原发肿瘤中对发育和转移的潜在作用。
综上所述，作者发现富集在CRC原发肿瘤的F3+成纤维细胞能够通过产生各种促肿瘤因子（包含NRG1，可与肿瘤细胞表达的ERBB2相互作用发挥它们的促肿瘤功能）调节发育和迁移。然而富集在LM的MCAM+成纤维细胞能够通过Notch信号通路调节CD8_CXCL13细胞的形成，与CC内促肿瘤亚群F3+成纤维细胞不同，表明不同癌症环境中基质细胞的异质性（图9B）。
图9. ST组织中细胞配受体通讯
（A）C1、C3、L1和L2中两个群的配受体对的通讯强度
（B）CC和LM中成纤维细胞与其它细胞的通讯模型
总结
在大多数病例中CRCLM是多步骤过程并且是致命的。作者公布了CRCLM的肿瘤和癌旁组织的TME图谱，揭示了在不同的癌环境中成纤维细胞的不同谱系和功能以及免疫细胞的动态性质，可用于进一步鉴定调节机制和潜在治疗靶点。文章局限性：所有样本均经过新辅助治疗，因此无法完全呈现CRC最原始的状态；由于受试者进行了不同的治疗，所以难以评估每一种治疗方法的影响；癌旁组织的基质细胞的特征尚不清楚，CC和LM基质细胞图谱差异的原因仍有待阐明；作者提出本研究的样本量相对比较小，仍需更大的群体去验证本研究的结论。