摘要
以往的研究报道，较短的平均端粒长度的淋巴细胞与增加易感性的常见疾病的老龄化，并可能预测癌症的风险。然而，大多数分析都检查了回顾性收集的病例对照研究。
平均端粒长度采用高通量实时荧光定量 PCR 测定。在东盎格鲁 SEARCH 乳腺癌(2243例，2181例对照)和 SEARCH 结直肠癌(2249例，2161例对照)研究的癌症诊断后收集用于 DNA 提取的血液。前瞻性病例对照研究进行了乳腺癌(199例)和大肠癌(185例) ，嵌套在 EPIC-诺福克队列。在诊断前至少6个月采集血液，并与每个病例的两个无癌对照组的 DNA 进行匹配。
在回顾性研究中，SEARCH研究中，平均端粒长度最短(Q4)与最长(Q1)四分位数的年龄调整优势比为15.5(95% CI 11.6-20.8) ，p-het = 5.7 × 10-75; “每四分位数”p 趋势 = 2.1 × 10.80为乳腺癌，2.14(95% CI 1.77-2.59) ，p-het = 7.3 × 10-15; “每四分位数”p 趋势 = 1.8 × 10-13为大肠癌。在 EPIC 的前瞻性研究中，可比的优势比[ Q4对 Q1]为1.58(95% CI 0.75-3.31) ，p-het = 0.23为乳腺癌，1.13(95% CI 0.54-2.36) ，p-het = 0.75为大肠癌风险。
平均端粒长度在回顾性收集的病例中比对照组短，但在前瞻性研究中相当的关联明显较弱。这表明端粒缩短主要发生在诊断后，因此可能不具有预测癌症的价值。
引言
人类染色体被端粒覆盖并稳定，端粒主要由几千个(TTAGGG) n 重复(1-3)形成，长度异质，在染色体和个体之间变化(4-8)。端粒防止染色体末端被识别为需要双链断裂修复的受损 DNA，从而防止染色体融合和重排，帮助保持基因组的完整性(9-12)。
端粒 DNA 复制效率低下。这被称为“末端复制问题”(1,13,14) ，导致平均端粒长度逐渐减少，估计为每年15-60bp (15,16) ，这一速率在50岁以上增加(5,17)。有报告指出，环境因素如吸烟(18-20岁)、氧化应激(21-23岁)、身体健康欠佳(24-26岁)和肥胖(18岁)可能会加速端粒损耗。因此，平均端粒长度被认为是衡量细胞和生物体“生物学年龄”的标准(27,28)。
先前的实验研究表明，端粒平均长度相对较短的个体可能会增加死于多种疾病的风险(20,29-38)。特别是，五项研究已经调查了乳腺癌风险与平均端粒长度之间的关系(35-39)。Shen 等[35]报道，端粒长度较短(287例，350例姐妹对照)的乳腺癌风险增加，临界统计学显着性增加; 优势比[最短 Q4与最长 Q1(参考)] = 1.55(95% 置信区间0.88-2.73) ，p = 0.14。来自同一组的第二项更大的研究(36)报道了50岁以下女性乳腺癌风险的显着相关性; OR [ Q4 vs. Q1] = 1.78(95% CI 1.15-2.76) ，p = 0.01。50岁以上女性的平均端粒长度与乳腺癌无关(36)。在这两项研究中，回顾性地收集病例个体的血液样本进行 DNA 提取——在癌症诊断之后。
到目前为止，已经发表了两篇关于平均端粒长度和大肠癌之间关系的研究(40,41)。在男性(191例，306例对照)和女性(134例，357例对照)中进行的这些前瞻性嵌套病例对照比较显示，端粒长度与疾病状态之间没有关联。
在这里，我们测量了前瞻性和回顾性收集的乳腺癌和大肠癌病例对照系列的平均端粒长度，以更精确地评估端粒长度与癌症状态之间的关系，并测试平均端粒长度是否对癌症易感性具有预测价值。
材料与方法
回顾性SEARCH 乳腺癌病例对照研究
SEARCH 乳腺研究(42)是一项正在进行的基于人群的研究，通过东部癌症登记和信息中心(ECRIC， http://www.ECRIC.org.uk/)确定病例，该中心是一个覆盖剑桥郡、诺福克、萨福克、贝德福德郡、赫特福德郡和埃塞克斯县的基于人群的癌症登记处。自1996年以来确诊的70岁以下妇女(事件个案，中位年龄55岁)有资格纳入。大约64% 符合条件的患者参加了这项研究。研究参与者被要求提供20毫升血液样本进行 DNA 分析，并完成一份全面的流行病学调查问卷。没有参加研究的符合条件的患者与参与者相似，只是非参与者中临床 III/IV 期病例的比例稍高。
在本报告中，我们使用了最近累积的、提取的和标准化的 DNA 样本，包括2004年至2007年间诊断的2243例事件病例和2181例对照。大多数(n = 1524)对照被收集作为 SEARCH 研究中的无癌史对照参与者，在2003年至2007年期间招募。其余的(n = 657)是从 EPIC (欧洲癌症前瞻性调查)的诺福克部分选择的无癌女性。对照在年龄上与病例大致相似(SEARCH 对照的中位年龄为53岁，EPIC 对照的中位年龄为54岁) ，SEARCH 对照另外与 SEARCH 病例的居住地区和年龄组频率相匹配。
前瞻性 EPIC 乳腺癌和结直肠癌病例对照研究
病例和对照样本来自欧洲癌症前瞻性调查(EPIC)的诺福克队列(http://www.srl.cam.ac.uk/EPIC/)。EPIC 是一项正在欧洲九个国家进行的关于饮食和癌症的前瞻性研究。EPIC-诺福克队列包括超过30,000人，年龄在45-75岁之间，居住在东安格利亚的诺福克，并在1993年至1997年期间从全科医生注册处招募。这是一个种族同质的人口，99% 以上被报道为欧洲白人。共有25,639名参与者完成了初步健康检查。1998年1月，该队列被邀请进行第二次健康检查，15,786人参加了第二阶段的检查。所有参与者均表示知情同意，并与东盎格鲁癌症登记处和联合王国国家统计局登记处进行比对。这些提供了整个队列的所有癌症登记、死亡和移民的通知，因此，失访率 < 0.1% 。
这项分析的合格病例是研究参与者，他们在基线评估中没有癌症，并且在抽血后至少六个月和直到2003年12月底被诊断出患有乳腺癌或大肠癌。全部数据分别用于199例和185例乳腺癌和大肠癌的端粒长度分析。符合条件的对照是研究参与者谁仍然没有癌症在这段时间。两个对照组按性别、年龄(一年内)和抽血日期(三个月内)对每个病例进行匹配。总共有384例乳房或大肠癌事件和826例匹配的对照参与者可供分析。从采血到确诊的平均时间为3.3年(范围为1.4至4.6年)。进一步的研究特征见补充表1b。
Real Time PCR
通过 SYBR Green Real Time PCR 测量端粒重复单位(TEL)与单拷贝基因(CON)的比率(TEL/CON)(20,43)确定相对平均端粒长度。TEL 测定法扩增78bp 端粒重复单位，并且检测到的荧光与可用于引物结合的基因组中的端粒重复数量成比例，因此与提取 DNA 的细胞中的平均端粒长度成比例。CON 分析扩增了单拷贝人 β-珠蛋白基因序列的一个片段，并用于校正加入到反应中的模板 DNA 的样品到样品的变异。
结果
质控
作为在三个病例对照系列中测定质量保证的措施，计算了在不同 PCR 批次中测定的相同样品的重复测量之间的相关性。在每项研究中，ΔCt 值≥0.83(CON PCR ≥0.92，TEL PCR ≥0.93)。超过97% 的试验样本给出了结果。对于 ΔCt 值，一式三份“检验”平板测定中的 Spearman 秩次相关性≥0.71(CON PCR ≥0.72，TEL PCR ≥0.87)。作为进一步验证所使用的测定，已知的平均端粒长度与年龄在未受影响的对照研究样本集(n = 5256)进行了检查。正如预期的那样，平均端粒长度随着年龄而显着降低(调整研究，性别和384孔板后) ; ΔCt‘ per year’= 0.0045(95% CI 0.003-0.006) ，p 趋势 = 1.5 × 10-9。
平均端粒长度与乳腺癌
回顾性和前瞻性乳腺癌研究中按四分位数 ΔCt 调整的估计优势比(年龄和平板)如表1所示。与前瞻性研究相比，回顾性研究观察到更强的相关性。在回顾性研究中，端粒长度四分位数呈下降趋势，“每四分位数”，平板和年龄调整 OR = 2.56(95% CI 2.32.5.23) ，p 趋势 = 2.1 × 10-80。ΔCt 最短(Q4)与最长(Q1)四分位数的比值比为15.5(95% CI 11.6-20.8) ，p-het = 5.7 × 10-75。尽管病例与本研究中来自两个不同来源的对照匹配，但与 SEARCH 对照匹配的患者[ OR‘每四分位数’= 2.44(95% CI 2.21-2.70) ，p 趋势 = 8.5 × 10-69]和匹配的患者通过 EPIC-Norfolk [2.18(95% CI 1.90-2.51) ，p 趋势 = 2.5 × 10-28]确定的对照。在50岁以下或50岁以上的受试者中，效应量没有显著差异，这是一个接近绝经前和绝经后状态的分类(数据未显示)。
对于每项研究，病例和对照中 ΔCt 的分布在补充图1中进一步说明。在所有四个小组中，病例分布偏向对照分布的右侧，但这在回顾性乳腺癌研究(左下)中最为显着，其中几乎一半的病例(2243例中的45% -1013例)位于最短的四分位数长度，Q4。
在前瞻性乳腺癌研究中，与 ΔCt 的关联与回顾性乳腺癌研究方向相同，但幅度小得多，无统计学意义。
平均端粒长度和大肠癌
大肠癌病例对照结果与乳腺癌研究的结果类似，尽管风险评估点较小(表2)。在回顾性结直肠研究中，平板和年龄调整的 OR‘每四分位数’= 1.25(95% CI 1.18-1.33) ，p 趋势 = 1.18 × 10-13; OR [ Q4 vs. Q1] = 2.14(95% CI 1.77-2.59) ，p-het = 7.3 × 10-15。在前瞻性大肠癌研究中没有证据表明两者之间存在联系。
讨论
我们采用定量 PCR 方法(20,43)来评估大规模流行病学研究中淋巴细胞的端粒长度。我们已经证明这种方法在多重重复测定中是可重复的，并且显示了已知随着年龄的增长而发生的端粒长度的预期缩短。
在回顾性研究中，我们发现较短的端粒长度与乳腺癌状态之间有很强的相关性，与顶部四分位数相比，端粒长度最低四分位数的女性的 OR 值约为15。
前瞻性乳腺癌研究显示，一些证据表明在同一方向的联系，但效果没有统计学意义。因此，淋巴细胞平均端粒长度是癌症风险预测因子的假说似乎被夸大了。除了一项之前发表的关于乳腺癌与平均端粒长度之间关系的研究外，其他所有研究都显示了与我们在这里报道的相同方向的关联。然而，大多数这些研究的效应大小与前瞻性研究相似，尽管这些研究主要是回顾性的。唯一一项关于乳腺癌风险和平均端粒长度的真正前瞻性研究(39)给出了与我们相似的风险估计; OR (39)[‘低于’和‘高于’中位长度] = 1.23(95% CI 0.94-1.60) ，p 趋势 = 0.20 vs. OR = 1.52(95% CI 0.90.2.58) ，p-het = 0.12。
可能是前瞻性研究的结果低估了任何关联的真实大小，这可能是由于这些研究的规模相对较小，或者仅仅是随机测量误差。研究规模不太可能导致我们忽略了搜索回顾性研究规模的真正关联。在我们的乳腺癌研究中，前瞻性和回顾性研究的置信区间几乎没有重叠，De Vivo 等(39)发表的研究显示使用两倍于我们的研究的相似点估计和置信区间。
我们在实质性回顾性乳腺癌研究中看到的影响比以前的报道大得多。统计学显着性的水平可能部分是由于研究规模的增加，但是大的比率提高了这种关联可能是人为的可能性，这是由于回顾性收集的研究容易出现的 DNA 收集，储存，质量或其他偏倚的差异。这种实时 PCR 检测非常依赖于均匀的 DNA 质量。然而，我们发现从不同来源获得的对照之间的平均端粒长度几乎没有差异。此外，我们假设 DNA 提取率与回顾性样品的 ΔCt 值之间没有相关性，这可能与 DNA 质量有关。当使用原始的整个研究 ΔCt 边界进行四分位数计算时，或当 ΔCt 的四分位数在逐板基础上重新计算时，没有明显的板偏倚(补充图2).然而，从补充图1中沿 x 轴的 ΔCt 值可以明显看出。不同实验的范围是不同的(注: 两个前瞻性研究在同一个实验中一起测定)。值得注意的是，从一个实验到另一个实验所产生的平均端粒长度是相对于该实验的，而不是绝对的。它们可以根据 PCR 效力和试剂批次而变化，但这些因素对等级或四分位数分配的影响很小。
参考